Page 36 - 南京医科大学自然版
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第44卷第11期
               ·1502 ·                           南 京    医 科 大 学 学         报                        2024年11月


              补成平末端，随后在3′末端加上1个A碱基，以加入                          以肿瘤细胞∶成纤维细胞=3∶1的比例铺入96孔板中
              adapter 序列；对连接 adapter 后的产物进行纯化和                 （每孔8 000个细胞），待细胞贴壁后，按组别加入不
              片段分选，用分选产物进行 PCR 扩增，并使用 Illu⁃                     同浓度（肿瘤细胞单独培养：0、31.25、62.50、125.00、
                  ®
              mina Stranded mRNA Prep，li富集文库；使用 Illumi⁃         250.00、500.00、1 000.00 ng/mL；肿瘤细胞与人成
              na NovaSeq X Plus 测序仪进行 RNA 测序。基因集                纤维细胞共培养：0、100、200、400、800、1 600、
              富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）由上         3 200 ng/mL）的PTX及无菌生理盐水（对照组）。细
              海美吉生物医药科技有限公司完成。将si⁃Ctrl与si⁃                      胞均置于37 ℃恒温、含有5% CO2的细胞培养箱中培
              LOX⁃1差异基因集与标准化GSEA分子特征数据库                         养48 h，通过CCK8试剂检测细胞活性，计算IC50值。
              基因集进行分析，探索LOX可能发挥作用的通路。                           1.3  统计学方法
              1.2.7 免疫组化染色                                           为了研究 LOX 与卵巢癌临床病理特征及初始
                  卵巢癌及癌旁组织来自南京医科大学附属妇                           治 疗 结 局 的 相 关 性 ，将 TCGA 卵 巢 癌 RNAseq
              产医院（南京市妇幼保健院）病理科，样本搜集获得                          （PFKM）数据根据LOX mRNA表达中位数分为高表
              该院伦理委员会的批准（批准号：2022KY⁃176）。用                      达组和低表达组，进行正态分布检验后，满足方差
              4%多聚甲醛固定组织24 h，石蜡包埋后进行连续切                         齐性的用 Student’s t 检验，不满足方差齐性的用
              片（委托武汉赛维尔生物科技有限公司完成），玻片                           Welch’s t检验。
              置于 60 ℃烘箱中过夜。次日，将切片按以下步骤处                              使用 GraphPad Prism7.0 软件对数据进行分析，
              理：二甲苯 30 min 2 次，梯度乙醇复水，每级 5 min；                 结果以均数±标准差（x ± s）表示，组间差异均用双
              用柠檬酸钠抗原修复液煮沸30 min修复抗原，在抗                         尾 Student’s t 检验，多组数据之间比较，采用 One
              原修复液中自然冷却后用 3%H2O2 灭活 10 min，用                    Sample Wilcoxon Signed Rank检验。P < 0.05为差异
              山羊血清常温封闭 30 min，按照说明书稀释并加                         有统计学意义。
              入α⁃SMA 及 LOX 一抗，4 ℃ 孵育过夜。次日用去
                                                                2  结 果
              离子水浸洗 3 次后室温孵育 HRP 标记的山羊抗兔
              IgG、HRP 标记的山羊抗小鼠 IgG 30 min，TBS 浸洗                2.1  LOX高表达与卵巢癌不良化疗结局相关
              3 次后用DAB工作液显色，镜下观察DAB显色并适                              肿瘤基质成分可通过多种机制调控肿瘤的进
              时终止。去离子水浸洗3次后苏木复染5 min，去离                         展和耐药，为筛选出卵巢癌基质中可能调控肿瘤进
              子水浸洗 3 次后在 TBS 中返蓝 5 min，再次用去离                    展和化疗敏感性的关键靶基因，本课题组比较了原
              子水浸洗 3 次。随后，梯度乙醇脱水及二甲苯，每级                         发肿瘤基质成分（n=11）与配对的大网膜转移的卵
              5 min，用中性树脂封片后在正置光学显微镜下观察。                        巢癌样本基质成分（n=11）中蛋白表达差异，筛选出
              1.2.8 细胞免疫荧光                                      了大网膜转移样本中显著上调的蛋白［差异倍数
                  将分离的人源成纤维细胞种于灭菌后已置入                          （fold change，FC）>5，错误发现率（false discovery rate，
                                                                           ［17］
              爬片的24 孔板上，培养24 h后吸去培养基，4%多聚                       FDR）<0.05］ ，并进一步与在耐药复发卵巢癌患者
              甲醛固定 15 min，用含 0.1% TritonX⁃100 的 PBST 室         （n=32）中相比敏感复发卵巢癌患者（n=26）的肿瘤
                                                                                                         ［18］
              温破膜 15 min。加入山羊血清常温封闭 30 min，按                    基质中显著上调的 mRNA（FC>2，FDR<0.05） 取
              照说明书稀释并加入α⁃SMA 及 Vimentin 抗体，4 ℃                  交集（图 1），结果发现，仅 LOX 同时在耐药卵巢癌
              孵育过夜。次日弃一抗后用 PBS 清洗 3 次爬片，并                       的肿瘤基质和大网膜转移的卵巢癌基质中显著
              加入荧光酶标记的抗鼠 IgG 常温避光孵育 2 h。弃                       上调。
              二抗，PBS 清洗 3 次后用即用型 DAPI 室温避光孵                          随后，通过比较 TCGA 数据库中 190 例 LOX 低
              育 5 min。PBS 清洗后，在载玻片上滴加抗荧光淬灭                      表达组及191例LOX高表达组卵巢癌患者临床病理
              液，将爬片倒扣在载玻片上并在激光共聚焦显微镜                            资料发现（表2），与低表达组相比，LOX高表达组无
              下进行拍摄。                                            肿瘤比例显著降低（30.6% vs. 69.4%，P < 0.001），提

              1.2.9  半数致死剂量（half⁃maximal inhibitory con⁃        示卵巢癌组织中 LOX 水平可能与肿瘤存在状态相
              centration，IC50）                                  关；与低表达组相比，初始治疗后 LOX 高表达组完
                  将 A2780 以及 OV⁃CAR3 单独或分别与转染                   全缓解患者的比例显著较低（45.6% vs. 54.4%，P <
              siRNA（siCtrl、siLOX⁃1、siLOX⁃2）的人源成纤维细胞             0.01），提示 LOX 高表达可能与卵巢癌化疗抵抗相
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