Page 18 - 南京医科大学学报自然科学版
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第44卷第2期
               ·156 ·                          南   京 医 科       大 学      学 报                        2024年2月


              录试剂盒和 miRNeasy Mini Kit 试剂盒（QIAGEN 公              2）h、2~8 ℃储存（24±8）h、-70~-90 ℃储存（15±7）d
              司，德国）；miR⁃124 和 miR⁃24 引物（Thermo Fisher           和（30±7）d 后用于检测。3 份样品在-70~-90 ℃储
              Scientific 公司，美国）；大鼠肿瘤坏死因子⁃α（tumor                存至少12 h，然后再室温解冻，3个循环后评估冻融
              necrosis factorα，TNF⁃α）ELISA 试剂盒、大鼠白细胞            稳定性。
              介素（interleukin，IL）⁃1β ELISA 试剂盒和大鼠 IL⁃10          1.2.2 循环miR⁃124的组织特异性研究
              ELISA试剂盒（江苏酶免实业有限公司）。                             1.2.2.1 肝毒性模型建立及样本采集
              1.2  方法                                                将雄性 SD 大鼠随机分为溶媒对照组和对乙酰
              1.2.1 循环miR⁃124的稳定性研究                             氨基酚组，分别单次经口灌胃给予0.5%羧甲基纤维

              1.2.1.1  大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery oc⁃       素钠或1 250 mg/kg的对乙酰氨基酚，每只大鼠的给
              clusion，MCAO）模型的建立                                药体积为 10 mL/kg。24 h 后将大鼠用 3%戊巴比妥
                  生理状态下，循环miR⁃124的表达量较低，可能                      钠腹腔注射麻醉，从腹主动脉采集 1 mL 血液放入
                                 ［13］
              干扰检测方法的评估 。因此建立大鼠MCAO模型                           EDTA⁃K2抗凝管中，使用RT⁃qPCR 检测miR⁃124；采
              并采集血液样本用于miR⁃124的检测，然后与文献结                        集3 mL血液放入含促凝剂和分离胶的试管中，使用
              果对比，对 miR⁃124 的检测方法进行评价。将雄性                       生化分析仪检测肝功能指标丙氨酸氨基转移酶
              SD大鼠随机分为对照组和模型组，对照组大鼠进行                           （alanine aminotransferase，ALT）和天门冬氨酸氨基
              假手术（只术前麻醉和血管分离，不结扎及插入线                            转移酶（aspartate aminotransferase，AST）。
              栓），模型组大鼠采用Zea⁃Longa线栓法建立MCAO模                     1.2.2.2 心脏毒性模型建立及样本采集
                ［14］
              型 。将大鼠使用3%戊巴比妥钠（30~45 mg/kg）腹腔                         将雄性 SD 大鼠随机分为溶媒对照组和盐酸异
              注射麻醉，分离并结扎右侧颈总动脉，在颈总动脉                            丙肾上腺素组，分别单次静脉注射给予0.9%氯化钠
              结扎靠近头端方向切 0.2 mm 的小切口。线栓从小                        注射液或2.5 mg/kg的盐酸异丙肾上腺素，每只大鼠
              切口插入颈总动脉，通过颈内动脉和颈外动脉的分                            的给药体积为 10 mL/kg。4 h 后根据 1.2.2.1 收集和
              叉进入颈内动脉。将线栓沿颈内动脉向入颅方向                             处理血样，使用RT⁃qPCR检测miR⁃124，使用免疫化
              推进，插入大脑前动脉和大脑中动脉的分叉处，从                            学发光法检测心脏功能指标高敏心肌肌钙蛋白 I
              而阻断同侧颈内动脉和对侧颈内动脉通过大脑前                             （high sensitivitycardiac troponin，hs⁃cTnI）。
              动脉的供血。脑缺血 2 h 后，将留在体外的线栓轻                         1.2.2.3 肾毒性模型建立及样本采集
              拉出 1 cm，以实现大脑中动脉再灌注。MCAO 手术                            将雄性 SD 大鼠随机分为溶媒对照组和硫酸庆
              后，将大鼠单笼饲养，注意保温。                                   大霉素组，分别连续 7 d 肌肉注射给予 0.9%氯化钠
                  在术后 16~24 h，使用 Longa 评分法对造模大鼠                 注射液或 80 mg/kg 的硫酸庆大霉素，每只大鼠的给
              进行神经功能评分         ［14］ 。中度局灶性神经功能缺损                药体积为 2 mL/kg。第 7 天给药 24 h 后根据 1.2.2.1
             （即行走时向左转弯，神经功能评分为 2 分）和重度                          收集和处理血样，使用RT⁃qPCR检测miR⁃124，使用
              局灶性神经功能缺损（即行走困难并向左倾倒，神经                           生化分析仪检测肾脏功能指标肾损伤分子 1（kid⁃
              功能评分为3分）的模型是稳定的模型，可以选择用                           ney injury molecule 1，KIM⁃1）、尿素氮（blood urea ni⁃
              于后续研究。随机选择2只稳定造模的大鼠，分离脑                           trogen，BUN）和肌酐（creatinine，CREA）。
              组织并用TTC溶液在37 ℃水浴中避光染色40 min。                      1.2.3 循环miR⁃124灵敏性的比较研究
              染色后，将脑组织置于4%福尔马林中4 ℃固定24 h。                            将雄性SD大鼠随机分为溶媒对照组、醋酸铅低
              固定后，缺血区域为白色，正常区域为红色。                              剂量和醋酸铅高剂量组，分别连续56 d经口灌胃给
              1.2.1.2 样本采集及循环miR⁃124的稳定性研究                      予去离子水、300 或 600 mg/kg 的醋酸铅溶液，每只
                  将 MCAO 造模成功的大鼠用 3%戊巴比妥钠                       大鼠的给药体积为 10 mL/kg。在第 1、7、56 天给药
             （30~45 mg/kg）腹腔注射麻醉，从腹主动脉采集血液                      前和/或给药后 1、4、8、24 h 采集血液检测 miR⁃124
              到含有EDTA⁃K2的抗凝管中，样本采集2 h内完成离                       的表达；在第 1、14、21、56 天给药前和给药后 1 h 采
              心并收集血浆样品。                                         集血液检测 IL⁃1β、IL⁃10 和 TNF⁃α的表达；在第 8、
                  将收集到的血浆样品分装为18份，每种保存条                         15、22、57 天采集脑组织检测 IL⁃1β、IL⁃10 和 TNF⁃α
              件使用 3 份样品独立检测。3 份新鲜血浆样品立即                         的表达；在第57天采集脑组织使用电感耦合等离子

              检测作为对照，其他分装样品分别在室温储存（6±                           体质谱检测铅暴露量，并采集脑组织用10%中性福尔
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