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第44卷第2期 周 慧，王 雁，李 华，等. 循环miR⁃124作为铅神经毒性标志物的灵敏性、稳定性和组织
2024年2月 特异性研究［J］. 南京医科大学学报（自然科学版），2024，44（2）：154-161 ·157 ·

马林固定至少24 h，石蜡包埋，制成3 μm的切片进行 用 RT⁃qPCR 检测目的基因 miR⁃124 和内参基因
HE染色，于光学显微镜下观察脑组织病理学改变。 miR⁃24，获得各自的扩增曲线、熔解曲线和标准曲
1.2.4 RT⁃qPCR检测 线。miR⁃124 和 miR⁃24 的扩增效率基本一致（1.09
根据miRNeasy Serum/Plasma Kit说明书的要求 vs. 1.13）；熔解曲线均为单峰，表明设计的引物可以
®
从血浆中提取总RNA，使用RT⁃qPCR检测目的基因 特异性扩增而不形成引物二聚体；相关系数分别为
［15］
miR⁃124 和内参基因 miR⁃24 。使用 miScript 逆转 0.985 2 和 0.987 1，线性良好（图 1B、C）。以上结果
录试剂盒合成 cDNA：将 9 μL 的 Template RNA 与 表明本实验室成功建立循环 miR⁃124 的检测方法，
4 μL的5×miScript HiFlex Buffer、2 μL的10×miScript 检测结果可靠。
Nucleics Mix、2μL 的 miScript Reverse Transcriptase 在大鼠脑缺血再灌注后 16~24 h 收集 MCAO 模
Mix和3 μL的RNase⁃free Water 混合，最终反应体积 型组和对照组大鼠的血液样本，使用已建立的方法
为 20 μL。反应在 37 ℃孵育 60 min，在 95 ℃温育 完成检测。与对照组大鼠相比，模型组大鼠循环
5 min。使用 miScript SYBR Green PCR 试剂盒进 miR⁃124的表达显著增加（12.60±6.71）倍（P < 0.01，
®
®
行 RT⁃qPCR 反 应 ：用 cDNA、引 物 、10×miScript n=6），与文献报道基本一致 ［16］ ，说明以上样本处理
Universal Primer 各 2 μL 以 及 4 μL 的 RNase⁃free 程序和检测方法可靠。
Water 和 10 μL 的 2 × QuantiTect SYBR Green PCR 2.2 研究循环miR⁃124的稳定性
Master Mix 混合反应。所有检测重复进行 3 次。 为了评估 miR⁃124 的稳定性，取 3 只成功造模

miR⁃124 和内参 miR⁃24 的前向引物均由 Thermo 的SD大鼠，采集血液样本处理后在不同保存条件下
Fisher Scientific 公司合成，序列分别为 5′⁃ATTA⁃ 保存不同时间。与新鲜血浆相比，在室温储存 6 h、
AGGCACGCGGTGAATG⁃3′和 5′⁃GTGCCTACTGAG⁃ 2~8 ℃储存 24 h、-70~-90 ℃储存 17、36 d 的血浆样
CTGATAT⁃3′，PCR试剂盒中备有反向通用引物。 本中，miR⁃124 的表达差异无统计学意义。同时，
1.3 统计学方法 miR⁃124在3个冻融循环后可以保持稳定（图2）。
实验数据以均值±标准差（x ± s）表示，使用 2.3 研究循环miR⁃124的组织特异性
SPSS Statistics 21.0 软件进行统计分析。组间比较 2.3.1 肝毒性模型中miR⁃124的表达变化
采用t检验、单因素方差分析或Kruskal⁃Wallis检验， 与溶媒对照组相比，1 250 mg/kg 对乙酰氨基酚
多重比较使用 Dunnett⁃t 检验，P < 0.05 为差异有统 组动物在给药后 24 h ALT 和 AST 显著升高（P <
计学意义。 0.01，表1），表明成功建立了对乙酰氨基酚诱导的大
鼠肝毒性模型。通过 RT⁃qPCR 检测血浆 miR⁃124
2 结 果
水平，与溶媒对照组相比，对乙酰氨基酚组大鼠
2.1 建立可靠的循环miR⁃124检测方法 miR⁃124 的表达显著降低（P < 0.01，表1）。
在随机选择的稳定 MCAO 模型中，经 TTC 染色 2.3.2 心脏毒性模型中miR⁃124的表达变化
后发现大鼠梗死侧脑组织呈现白色梗死灶，而对侧 hs⁃cTnI 是一种对心肌功能障碍具有高度敏
非梗死脑组织呈现红色（图1A），表明成功制备脑缺 感性和特异性的血清生物标志物。与溶媒对照组
血再灌注模型。 相比，2.5 mg/kg 异丙肾上腺素组动物给药后 4 h 见
从成功造模的 MCAO 大鼠中收集血浆样本，使 hs⁃cTnI 显著升高（P < 0.001，表 2），表明成功建立

A B C
miR⁃124
miR⁃124
37.0 y=-3.110 7x+34.372 29.0 y=-3.0403x+28.196
36.0
28.5
miR⁃24 35.0 Amplification efficiency=1.09 miR⁃24 28.0 Amplification efficiency=1.13
2
R =0.987 1
2
R =0.985 2
27.5
34.0
of 33.0 of 27.0
32.0
26.5
values 31.0 values 26.0
25.5
30.0
Ct 29.0 Ct 25.0
24.5
28.0
27.0 24.0
-0.5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4
log10 of relative［CDNA］ log10 of relative［CDNA］
A：TTC staining results of rat brain tissues in MCAO models. B：Standard curve of target gene miR⁃124. C：Standard curve of reference gene miR⁃24.
图1 建立可靠的循环miR⁃124检测方法
Figure 1 Establishment of a reliable miR⁃124 detection method