Page 26 - 南京医科大学学报自然科学版
P. 26

第44卷第2期
               ·164 ·                          南   京 医 科       大 学      学 报                        2024年2月


              CUR⁃PM。最后，经真空冷冻干燥处理后，将其存储                         上清中药物质量）/投入药物量×100%］。
              在4 ℃冰箱中备用。不含CUR 的PM的制备方法同                         1.2.8 支架力学评价
              上。                                                     使用材料测试机在37 ℃下进行压缩性能测试，
              1.2.2 复合支架的制备                                     负载为0.1 N，压缩速度为0.1 mm/s。绘制应力⁃应变
                  采用冷冻干燥法制备HGSC复合支架。简述如                         曲线。
              下，在超纯水中制备 2% HA、2% SA 和 6% GEL，并                  1.2.9 支架降解评价
              以 1∶1∶1 的比例混合。使用磁力搅拌器搅拌混合                              在开始体外降解试验之前，所有样品支架干燥
              物，并加入 CUR⁃PM。用 0.33 mm 的 DD135⁃N 喷嘴、              并称重以确定初始重量。随后，将所有样品浸泡在
              印刷速 3 mm/s、压力范围 0.30~0.45 MPa 进行印刷，               PBS中，并在37 ℃下保存3、7、14、28 d。在每个时间
              最终得到表观体积为6.00 mm×2.81 mm×2.15 mm的                 点，取出样品干燥处理，重新称重以测定降解后重
              三维支架。待印刷完成后，将两组支架浸入2.5%氯                          量，计算支架降解率=（初始重量-降解后重量）/初始
              化钙溶液中12 h。最后使用去离子水冲洗支架3次，                         重量×100%。
              在真空冷冻干燥12 h后备用。                                   1.2.10 细胞培养
              1.2.3 材料微观表征                                           在实验前，所有复合支架都经过环氧乙烷灭菌
                  使用扫描电镜对微球和支架的形貌进行评                            处理。在细胞培养箱中37 ℃、5% CO2条件下进行培
              价。此外，将50 mg PM 样品用超声波（360 W，10 s）                 养，使用含 10%胎牛血清和 1%青链霉素溶液的
              分散到 10 mL 蒸馏水中，使用纳米粒度分析仪通过                        DMEM 培养基进行培养。每 2 d 更换培养基，待细
              动态光散射（dynamic light scattering，DLS）确定微球           胞达到80%融合时传代，用于后续实验。按照国际
              大小分布。                                             标准化组织（ISO 10993⁃12）的要求获得浸提液
              1.2.4 傅里叶变换红外光谱法分析材料组成                            （scaffold extraction solution，SE）。无菌支架以0.1 g/mL
                  将 HGS/HGSC 支架样品压平后放置在光谱仪                      的比例浸泡在无血清的 DMEM 培养基中。在细胞
              中，其分辨率为 4 cm ，以获得 400~4 000 cm 范围                 培养箱中孵育48 h后，收集上清液，无菌过滤，加入
                                                      -1
                                 -1
              内的光谱结果。                                           10% PBS和1%青链霉素溶液后在4 ℃保存，空白组
              1.2.5 生物墨水流变学分析                                   为无血清的 DMEM 培养、对照组为 HGS 支架组、实
                  首先将生物墨水铺在流变仪板上，接着在室温                          验组为HGSC支架。
              条件下，以 0~100 s 的剪切速率施加 5%的应变振                      1.2.11 支架的毒性和增殖特性评价
                               -1
              幅，进行小振幅震荡剪切实验。在 15~45 ℃的温度                             通过 CCK⁃8 试剂盒检测支架对细胞的增殖影
              范围内，记录储存模量（G′）和损失模量（G″）。                          响，将 BMSC 细胞以 4×10 个/孔的密度接种于 96 孔
                                                                                       3
              1.2.6 药物累积释放率                                     板，按照说明书与 SE 分别孵育 1、3、5 d。随后，使
                  分别将制备好的CUR⁃PM和HGSC支架分别置                       用酶联免疫吸附测定仪测量每孔在 450 nm 处的吸
              于含有 30 mL PBS 离心管中并在 37 ℃的恒温下孵                    光度。接着使用EdU试剂盒进行增殖评价，将BMSC
                                                                       5
              育。在预定的时间点，收集2 mL上清液并用新鲜PBS                        以 1×10 个/孔密度种植在96孔板中，孵育1 d，根据试
              替换，以保持30 mL的总体积，使用紫外可见光谱法                         剂商说明书提示进行荧光染色。
              测定药物释放率，使用公式（1）进行计算。                              1.2.12 支架对内皮细胞管形成能力评价
                  CUR⁃PM 累积释放率=药物释放量/支架中总药                           先将基质胶提前1 d 4 ℃下解冻，接着快速将基

                                                                                                   4
              物量×100 %                                  （1）     质胶涂覆到 48 孔板上。然后将 3×10 个/孔的 HU⁃
              1.2.7 负载CUR微球的载药率和封包率                             VEC 细胞直接接种到基质凝胶层上并用 SE 培养。
                  将一定量的CUR⁃PM溶解于5 mL DCM中，然后                    孵育6~7 h后，进行钙黄绿素荧光染色，并采用倒置
              加入 2 mL 二甲基亚砜使药物充分溶解。将混合液                         荧光显微镜记录HUVEC 在每组基质凝胶上形成的
              超声浸泡1 min后，加入10 mL PBS中，搅拌至二氯甲                    网格状荧光，并且对节点和分支数量进行定量分
              烷（dichloromethane，DCM）完全蒸发。10 000 r/min离          析，试验重复3次。
              心 15 min，收集上清液，用 310 nm 波长的紫外分光                   1.2.13 ALP染色
                                                                                          4
              光度计分析，分别计算载药率（微球中的药物质量/                                在 6 孔板中接种 5.0×10 个/孔 BMSC 并用 SE 培
              微球的总质量×100%）和包封率［（微球中药物质量-                        养 7 d 后，根据制造商的说明书使用 ALP 检测试剂
   21   22   23   24   25   26   27   28   29   30   31