Page 34 - 南京医科大学学报自然科学版
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第44卷第2期
·172 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2024年2月
合。筛选结束后，为标准化蛋白质靶点信息，统一 加入，在室温下放置浸泡 1 h，回流煎煮 1 h，过滤药
在 Uniprot 蛋白质数据库（https：//www.uniprot.org）将 液后。再次加入 10 倍水回流煎煮 1 h，将过滤药液
化合物作用的蛋白质靶点进行规范。 与之前药液合并，记录 2 次煎煮的药液回收量。将
1.2.2 结直肠癌相关靶点构建 药液进行浓缩，将完成浓缩的药液放置干燥箱中进
以“Colorectal cancer”为关键词，分别在 Gene⁃ 行干燥，48 h后，得药干冻粉，保存至-80 ℃冰箱进行
Cards 数据库（https：//www.genecards.org）、Drugbank 后续实验。在实验开始前在无菌条件下称取适量臭
数据库（https：//go.drugbank.com）、Pharmgkb 数据库 椿皮散粉末，加入PBS并经过涡旋、超声等方式使臭
（https：//www.pharmgkb.org）和 TTD 数 据 库（https：// 椿皮散粉末完全溶解，用0.22 μm滤器过滤并配制成
db.idrblab.net/ttd）中进行检索，获得的基因集作为疾 实验所需药物浓度，放置于-20 ℃保存。
病靶点，若靶点过多设定Score大于中位数的目标靶 1.2.7 CCK⁃8法检测细胞活性
点为结直肠癌的潜在靶点，合并4个数据库靶点后， 将臭椿皮散配制成不同的药物浓度，取对数生
删除重复值得到结直肠癌靶点。将药物靶点和疾 长期 MC38、Caco2 细胞，以 1 000 个/孔接种于 96 孔
病 靶 点 输 入 到 Venn Diagrams（www.bioinformatics. 板，每孔加入 100 μL 细胞悬液，培养过夜。实验分
com.cn/static/others/jvenn/example.html）数据库中获 组每组 4 个复孔，分别干预 24 h、48 h、72 h，每孔加
得交集靶点，制作韦恩图。 入含 10 μL CCK⁃8 的培养基，37 ℃、5% CO2条件下
1.2.3 臭椿皮散⁃结直肠癌靶点PPI网络构建 避光培养 2 h，于酶标仪 450 nm 波长处检测各孔吸
将 交 集 靶 点 提 交 到 STRING 数 据 库（https：// 光度（OD值）。
string⁃db.org）构建蛋白互作（protein⁃protein interac⁃ 1.2.8 流式细胞术
tion networks，PPI）网络，将生物种类设置为“Homo 根据臭椿皮散浓度分为空白对照组（0 μg/mL）、
sapiens”，最小互相作用阈值设定为“highest confi⁃ 低剂量组（125 μg/mL）、中剂量组（250 μg/mL）和高
dence”（＞0.9），其余设置均为默认设置，进而得到 剂量组（500 μg/mL），处理 MC38 细胞 24 h。采用
PPI 网络。通过 Cytoscape（https：//cytoscape.org）内 FITC 标 记 的 膜 联 蛋 白 ⁃ V（annexin ⁃ V）/碘 化 丙 啶
置工具分析靶点的网络拓扑参数，包括 Degree、Be⁃ （propidium iodide，PI）双染法和流式细胞术检测细
tweenness及Closeness，确认网络中的核心靶点。 胞凋亡。按照 FITC 凋亡检测试剂盒的操作规程进
1.2.4 GO和KEGG富集分析 行染色，以流式细胞仪进行检测。未经PI染色的荧
为了进一步明确臭椿皮散抗结直肠癌的可能 光素阳性细胞被认为是凋亡细胞，使用 Flowjo 软件
机制，利用 R 语言 ClusterProfile 程序包对靶点进行 进行数据分析，确定凋亡细胞百分比。
KEGG 和 GO 富集分析，筛选前 10 个生物过程（bio⁃ 1.2.9 划痕实验
logical process，BP）、分子功能（molecular function， 将结直肠癌细胞MC38按上述实验分组后接种
MF）、细 胞 组 分（cellular component，CC）和 前 于6孔板内，待细胞融合达95%以上，用无菌枪头划
30 个 KEGG 通路，将所得结果进行可视化处理，分 细胞单层，形成划痕，磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗 3 次
别以柱形图和气泡图展示结果。 除去划下的细胞碎片，继续用含1%胎牛血清DMEM
1.2.5 分子对接 培养基进行培养，分别在 0 h 和 24 h 时间点于 10 倍
在 Pubchem 数 据 库（https：//pubchem.ncbi.nlm. 光学显微镜下进行拍照记录，通过Image J软件计算
nih.gov）中确定化合物名称、分子量和 3D 结构，在 细胞迁移率：（0 h 划痕距离-24 h 划痕距离）/0 h 划
RCSB PDB数据库（https：//www.rcsb.org）中下载活性 痕距离×100%。
成分所对应的 3D 结构。利用 AutoDockVina 软件 1.2.10 Western blot实验检测相关蛋白
（autodock.scripps.edu）对接配体和蛋白质，将目标蛋 用细胞裂解液（RIPA裂解液，1%蛋白酶抑制剂
白晶体进行去除水分子、加氢处理，将靶点结构与 和1 mmol/L PMSF）重悬细胞MC38，4 ℃ 12 000 r/min
活性成分进行分子对接，利用 Vina 进行对接，并使 离心15 min，取上清，测定蛋白浓度。在蛋白原液中
用Pymol软件（https：//www.pymol.org）进行可视化。 加入5×上样缓冲液，100 ℃下煮沸15 min，进行十二
1.2.6 臭椿皮散水提物的制备 烷基硫酸钠⁃聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS⁃PAGE），恒
取臭椿皮散称重，按比例（臭椿皮30 g，干姜15 g， 流将蛋白转移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，用 5% 牛
槐耳15 g，鸡冠花15 g，甘草9 g，附子9 g）以10倍水 血清白蛋白（BSA）室温封闭 1 h，4 ℃过夜孵育抗体
