Page 60 - 南京医科大学学报自然科学版
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第44卷第2期
               ·198 ·                          南   京 医 科       大 学      学 报                        2024年2月


              同作用下发生的。目前的研究大多集中在蛋白质                             20 000 g 4 ℃离心30 min，取上清液以备质谱进样分析。
              成分上，对微环境代谢组如何影响肿瘤存活知之甚                            1.2.2 LC⁃MS检测
              少 。                                                    整个分析过程中样品置于 4 ℃自动进样器中，
                ［3］
                  代谢组学是对细胞、生物体液、组织或生物体                          样品采用Shimadzu Nexera X2 LC⁃30AD 超高效液相
              内低分子量（<1 kDa）的内源性小分子（通常称为代                        色谱系统（UHPLC）使用 HSS T3 色谱柱进行分离。
              谢物）的大规模研究。代谢组学与基因组学、转录                            其中进样量5 μL，柱温40 ℃，流速0.2 mL/min；色谱
              组学和蛋白质组学一起，在生理和病理过程中推动                            流动相 A为0.1%甲酸水溶液，B为乙腈。
              基因型和表型之间的联系，成为生物标志物发现、                                 每例样品分别采用电喷雾电离（electrospray
                                             ［4］
              药物开发和个性化医疗的有力工具 。代谢组学研                            ionization，ESI）进行正离子（+）和负离子（-）模式检
              究诊断许多疾病的重要性已经被证明，如白血病、                            测。 样品经 UPLC 分离后用 QTRAP 5500 质谱仪进
              卵巢癌、食管癌、口腔癌、乳腺癌和前列腺癌等 。                           行质谱分析，使用 HESI 源进行离子化。采用 MRM
                                                         ［5］
              本研究拟利用广泛靶向代谢组学技术和外显子测                             模式检测待测离子对。
              序技术分析，找到 ALL 患者血清代谢组学的改变，                         1.3  统计学方法
              寻找与 ALL 相关的潜在代谢生物标志物及基因改                               两组间数据利用多元变量统计分析，包括主成
              变以指导临床。                                           分分析（principal component analysis，PCA）、偏最小

                                                                二 乘 判 别 分 析（partial least squares discrimination
              1  对象和方法
                                                                analysis，PLS⁃DA）、正 交 偏 最 小 二 乘 判 别 分 析
              1.1  对象                                           （OPLS⁃DA）和单变量统计分析（Student’s⁃t 检验和
                  选取2021年9月—2022年5月首次在南京医科                      火山图）进行联合分析，本项目使用的卡值标准为
              大学第一附属医院儿科就诊的初发且未经治疗的                             P<0.05，同时OPLS⁃DA模型第一主成分的变量投影
              ALL 患儿 4 例为 ALL 组，选取同期在本院进行体检                     重要度（variable Importance for the projection，VIP）＞
              的健康儿童4例为对照组。由于代谢产物受多种因                            1。以倍数变化（fold change，FC）代表 ALL 组与对照
              素的影响，除疾病本身外，如患者饮食习惯、合并症                           组的代谢物含量比值，选取FC≥1.5或 FC≤0.5变化水
              和药物使用情况等均可能对实验结果产生影响，在                            平的差异代谢物，然后根据京都基因和基因组百科全
              选取病例时参照以下标准：①ALL患儿为初发患者，                          书数据库（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，
              尚未接受化疗药物治疗；②无代谢性疾病及其他血                            KEGG）进行差异代谢物通路分析以确定显著变化的
              液性疾病；③无长期服用药物病史。本研究通过南                            代谢途径。
              京医科大学第一附属医院伦理委员会审核（2017⁃
                                                                2  结 果
              SRFA⁃091），在研究对象签署知情同意书的基础上，
              进行血样的采集。                                          2.1  标本质量检测
                  乙腈、甲醇、Formic acid（Millipore 公司，美国）；                广泛靶向代谢组学标准品正负离子模式下提
              氨水（Merck 公司，美国）；乙酸铵（Sigma 公司，美                    取离子流色谱图（extracted ion chromatogram，EIC 或
              国）。质谱仪（AB SCIEX公司，美国）；超高压液相色                      XIC），从图中可见各代谢物色谱峰分离较好，峰形尖
              谱仪（Shimadzu公司，日本）；色谱柱（Waters公司，美                  锐对称，能够对各代谢物进行质谱定量（图1）。
              国）；超声波系统（Diagenode 公司，比利时）；真空离                    2.2  代谢组学分析
              心浓缩仪、离心机（Eppendorf公司，德国）；可见紫外                     2.2.1 PCA、PLS⁃DA和OPLS⁃DA分析
              分光光度计（Thermo公司，美国）。                                    将 ALL 组和对照组的血清代谢物进行 PCA 分

              1.2  方法                                           析。结果显示（图2），第一主成分（PC1）的贡献率为
              1.2.1 血清代谢物提取                                     29.92%，第二主成分（PC2）的贡献率为 15.58%，两
                  收集血清样本，每个样本各取 100 μL，加入                       组样本表现出明显的分离趋势。图 3A 为比对组的
              100 μL 预冷的水和 800 μL 甲醇/乙腈（2∶2，V/V），涡              PLS⁃DA得分图，两组间差异明显，图3B为比对组的
              旋混合，冰浴中超声 30 min，-20 ℃静置过夜，16 000 g               PLS⁃DA 置换检验图，200 次置换检验未发生拟合。
              4 ℃离心 30 min，取上清，上清在高速真空浓缩离                       模型评价参数见表 1。比对组的 R2X 为 0.605，R2Y
              心机挥干，样本复溶于 100 μL 50%甲醇水溶液中，                      为 1，Q2 为 0.958，表明本次质谱检测模型的稳定性
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