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第44卷第3期        胡   君，戴   丽，陈 霞，等. 神经肽Y/Y1受体激活β⁃catenin信号通路介导心肌细胞损伤［J］.
                  2024年3月                     南京医科大学学报（自然科学版），2024，44（3）：313-321                        ·315 ·


                号：XMLL⁃2023⁃036），饲养于江苏医药职业学院实                     录试剂合成 cDNA。Real⁃time RT⁃PCR 检测心肌组
                验动物中心，恒温（23 ± 1）℃，人工照明（白天/黑夜                      织中 NPY 和细胞中肥大基因心房钠尿肽（atrial na⁃
                各 12 h）。大鼠心肌细胞 H9C2（上海中国科学院细                      triuretic peptide，ANP）、β⁃肌球蛋白重链（β⁃myosin
                胞库）；L⁃DMEM、胎牛血清、0.25%胰酶（Hyclone 公                 heavy chain，β⁃MHC）mRNA 表达，以 GAPDH 作为内
                司 ，美 国）；ISO（HY ⁃ B0468，Sigma 公 司 ，美 国）；           参。具体引物序列见表1。
               ［Leu31，Pro34］⁃NPY（HY⁃P1323）、Y1受体特异性拮                              表1   PCR引物序列
                抗剂 BIBO3304（HY⁃107725）（MCE 公司，美国）；                           Table 1 PCR primer sequences
                β⁃catenin 特异性抑制剂 ICG001（SF6827，杭州碧云
                                                                      Genes              Sequences（5′→3′）
                天 公 司）；NPY 抗 体［Neuropeptide Y（D7Y5A），                NPY          F：GATACTACTCCGCTCTGCGACAC

                11976］、磷酸化糖原合成酶激酶⁃3β（phospho⁃glyco⁃                               R：GGCGTTTTCTGTGCTTTCCT
                gen synthesis kinase 3β，p ⁃ GSK3β）抗 体［phospho ⁃      ANP          F：TTCGGGGGTAGGATTGACAG
                GSK3β（Ser9）（D85E12），5558］、总糖原合成酶激酶⁃                               R：CACACCACAAGGGCTTAGGA
                3β（total glycogen synthesis kinase 3β，t⁃GSK3β）抗体     β⁃MHC        F：GAGCAGGAGCTGATCGAGAC
                                                                                  R：ATGGCCTTCTTGGCCTTCTC
               ［GSK3β（D5C5Z），12456］、active⁃β⁃catenin抗体［non
                                                                     GAPDH        F：AGACAGCCGCATCTTCTTGT
                ⁃phosph（Active）β⁃catenin（Ser45）（D2U8Y），19807］
                                                                                  R：TACGGCCAAATCCGTTCACA
               （CST 公司，美国）；GAPDH 抗体（PB1034）、HRP 标
                记的抗兔 IgG（PA2202）（Proteinbio 公司，美国）；               1.2.5 Western blot检测蛋白表达
                Actin ⁃ Tracker Red ⁃ 555（微 丝 红 色 荧 光 探 针）            心肌组织或细胞样品中加入 PIPA 裂解液（含
               （C2203S，杭州碧云天公司）；AF488 标记的抗兔 IgG                   1 mmol/L 蛋白酶抑制剂和 1 mmol/L 磷酸化酶抑制
               （AB0141，Abways公司，美国）；ECL显影液（Biosharp               剂）提取心肌或细胞的总蛋白。蛋白定量后与上样
                公司，美国）；TRIzol试剂（Invitrogen公司，美国）；反转               缓冲液混合，金属浴煮沸5 min变性，之后进行SDS⁃
                录试剂盒和qPCR mix（Vazyme公司，美国）；CCK⁃8试                 PAGE电泳分离。快速湿转将蛋白转移到PVDF膜，
                剂（Glpbio公司，美国）。                                   5%脱脂牛奶室温封闭 1 h，加入一抗（NPY，1∶1 000
                1.2  方法                                           稀释；p⁃GSK3β，1∶1 000 稀释；t⁃GSK3β，1∶1 000 稀
                1.2.1 实验动物分组                                      释；active β⁃catenin，1∶1 000稀释；GAPDH，1∶5 000稀
                    4周龄雄性小鼠随机分成4组，包括对照组、ISO                       释），4 ℃摇床孵育过夜。TBST 清洗 3 次，每次
                组、BIBO3304+ISO组、BIBO3304组，每组10只。对照                10 min。之后加入HRP⁃标记的二抗（1∶5 000稀释）
                组皮下注射生理盐水；ISO组皮下注射20 mg/（kg·d）                    室温孵育 2 h，TBST 清洗 3 次，每次 10 min。ECL 显
                ISO；BIBO3304+ISO 组 腹 腔 注 射 0.1 mg/（kg · d）        影，Image J软件对蛋白灰度值进行定量分析。
                BIBO3304，30 min 后皮下注射 20 mg/（kg·d）ISO；            1.2.6 CCK⁃8法检测H9C2细胞活力
                BIBO3304 组腹腔注射 0.1 mg/（kg·d）BIBO3304，所                H9C2 细胞以 6×10 个/mL 接种至 96 孔培养板
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                有组连续给药14 d。                                       上，24 h后细胞饥饿过夜，分别加入不同浓度（0、10、
                1.2.2 HE和Masson染色                                 100 nmol/L）的［Leu31，Pro34］⁃NPY 处理细胞 48 h。
                    收集各组小鼠心肌组织置于 4%多聚甲醛中固                         之后向每孔中加入 10 μL CCK⁃8 工作液，37 ℃培养
                定过夜，用梯度乙醇进行脱水处理、石蜡包埋、切片                           箱内孵育2 h。用酶标仪检测450 nm处每孔的吸光
               （5 μm），最后置70 ℃烘箱烤片2.5 h，HE染色观察心                    度值，并计算心肌细胞活力。
                肌纤维形态结构；Masson染色观察心肌纤维化程度。                        1.2.7 免疫荧光染色
                1.2.3 细胞培养                                            H9C2 细胞以 1×10 个/mL 密度接种至 24 孔板
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                    H9C2细胞接种于6孔培养板上，用含10%胎牛                       中，24 h 后细胞饥饿过夜。Y1 受体特异性拮抗剂
                血清的L⁃DMEM培养24 h后，无血清L⁃DMEM饥饿                      BIBO3304（1 μmol/L）或β⁃catenin特异性抑制剂ICG001
                处理过夜，用不同浓度（0、10、100 nmol/L）［Leu31，               （1 μmol/L）预 处 理 细 胞 30 min 后 ，用 100 nmol/L
                Pro34］⁃NPY处理细胞24 h或48 h后进行相应的实验。                 ［Leu31，Pro34］⁃NPY 处理细胞。4%多聚甲醛固定

                1.2.4 荧光定量PCR                                     细胞，PBS清洗3次。0.2% TritonX⁃100处理30 min，
                    TRIzol 法提取细胞样品中的总 RNA，采用反转                    PBS 清洗 3 次。3%BSA 封闭细胞 60 min，PBS 清洗
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