Page 26 - 南京医科大学学报自然科学版

第44卷第3期
·316 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2024年3月

3 次。细胞骨架染色：加入 Actin⁃Tracker Red⁃555 2.2 BIBO3304缓解ISO诱导的心肌损伤和纤维化
4 ℃过夜后滴加 DAPI 染细胞核 10 min，PBS 清洗 对照组小鼠皮下注射生理盐水 2 周后，心肌纤
3 次，荧光显微镜观察拍照。β⁃catenin 入核检测： 维没有出现明显损伤，心肌细胞排列整齐，纤维结
孵育β⁃catenin 一抗 4°C 过夜，PBS 清洗 3 次后加入 构清晰，无明显纤维化。与对照组相比，ISO 组小
AF488 标记的抗兔二抗（1∶100 稀释），室温下孵育 鼠心肌组织 HE 染色出现明显的心肌细胞坏死、
2 h；滴加DAPI染细胞核10 min，PBS清洗3次，荧光 心肌细胞溶解；Masson 染色显示心肌组织胶原沉
显微镜观察拍照。采用 Image J 软件对细胞面积 积明显增加，并向周围间质延伸。与 ISO 组相比，
进行定量分析。 BIBO3304+ISO组心肌细胞损伤有所缓解，心肌组织

1.3 统计学方法 胶原沉积明显减少。与对照组相比，BIBO3304组小
数据结果采用GraphPad Prism 7软件进行处理。 鼠心肌纤维结构和心肌胶原沉积程度无明显改变
符合正态分布的计量资料以均数±标准差（x ± s）表 （图2A、B）。与对照组相比，ISO组小鼠心肌肥大基
示。两组间数据比较采用独立样本t检验；多组间数 因 ANP、β⁃MHC mRNA 表达显著增加；与 ISO 组相
据比较采用单因素方差分析。两两比较采用SNK⁃q 比，BIBO3304+ISO 组小鼠 ANP、β⁃MHC mRNA 表达
检验，P < 0.05为差异有统计学意义。 降低（P < 0.01）。与对照组相比，BIBO3304 组小鼠
ANP、β⁃MHC mRNA表达无明显变化（图2C、D）。
2 结 果
2.3 ［Leu31，Pro34］⁃NPY诱导H9C2心肌细胞损伤
2.1 ISO组小鼠心肌组织NPY水平增加 为探索NPY/Y1受体对心肌细胞的直接生物学
与对照组相比，ISO组小鼠皮下注射20 mg/（kg·d） 效应，用不同浓度（0、10、100 nmol/L）的Y1受体特异
ISO 14 d 后，心肌组织中 NPY mRNA 和蛋白表达显 性激活剂［Leu31，Pro34］⁃NPY 处理H9C2细胞24 h，
著增加，差异有统计学意义（P < 0.05，图1）。 定量 PCR 结果显示心肌肥大基因 ANP、β⁃MHC
mRNA 表达显著增加（P < 0.01，图 3A、B）。CCK⁃8
检测发现，［Leu31，Pro34］⁃NPY 处理H9C2细胞48 h
A
10
** 后细胞活力明显下降（P < 0.01），呈现剂量依赖效
8
Relative NPY mRNA level 6 4 应（图 3C）。
BIBO3304 缓解 ISO 诱导激活的β⁃catenin 信号
2.4
通路

0 2 与对照组相比，ISO组p⁃GSK3β、active β⁃catenin
Control ISO
表达增加，p⁃GSK3β/t⁃GSK3β比值增加，提示β⁃catenin
B Control ISO 信号通路激活。与 ISO 组相比，BIBO3304+ISO组
NPY 11 kDa active β⁃catenin 和 p⁃GSK3β/t⁃GSK3β表达显著下降
37 kDa （P < 0.05）。BIBO3304 组与对照组相比，active β⁃
GAPDH
catenin和p⁃GSK3β/t⁃GSK3β表达差异无统计学意义
C 2.5 * （图4）。
2.0
2.5 ［Leu31，Pro34］⁃NPY激活β⁃catenin信号通路
Relative NPY protein expression 1.5 NPY 增加 active β⁃catenin、p⁃GSK3β表达，active β⁃
与对照组相比，Y1 受体激动剂［Leu31，Pro34］⁃
1.0
0.5
0
0.05，图5A~C），提示β⁃catenin信号通路激活。与对
Control ISO catenin/GAPDH、p⁃GSK3β/t⁃GSK3β比值增加（P <
A：Relative NPY mRNA level in the myocardial tissue of mice de⁃ 照组相比，［Leu31，Pro34］⁃NPY促进细胞核β⁃catenin
tected by qPCR. B，C：NPY protein expression in the myocardial tissue 增加；与［Leu31，Pro34］⁃NPY 组相比，BIBO3304 抑
of mice detected by Western blot（B），and quantitative analysis results
制细胞核β⁃catenin积累（图5D）。
*
**
of NPY protein expression（C），P < 0.05，P < 0.01（n=4）.
图1 小鼠心肌组织中NPY mRNA和蛋白表达 2.6 抑制β⁃catenin 信号通路缓解［Leu31，Pro34］⁃
Figure 1 Expression of NPY mRNA and protein in myo⁃ NPY诱导的H9C2细胞损伤
cardial tissue of mice 与［Leu31，Pro34］⁃NPY 组相比，ICG001 显著抑