Page 26 - 南京医科大学自然版
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第44卷第4期
               ·464 ·                            南 京    医 科 大 学 学         报                        2024年4月


                                                                                                 -/-
              CGTGTAAGCTGAAG⁃ 3′；Coq4⁃KO⁃R：5′⁃GATGT⁃            346⁃1 号小鼠胚胎的基因型是 Coq4 。为了检验
              GACAAGCTCCCATTCTAACT⁃3′）从敲除的等位基                   Coq4 全敲小鼠模型的敲除效率，将 WT 和 Coq4 小
                                                                                                           -/-
              因中扩增 611 bp 的条带。扩增程序：95 ℃ 5 min；                  鼠的胎盘进行RNA⁃seq。结果表明Coq4在WT小鼠
              95 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，32个循环；72 ℃ 7 min。   胎盘中有表达，而在同窝 Coq4 小鼠的胎盘中没有
                                                                                            -/-
              1.2.3 组织切片及HE染色                                   观察到 Coq4 的表达（图 2B），这证明 Coq4 全身敲除
                  采用江苏省集萃药康有限公司的 Coq4 雌雄                        小鼠模型成功构建。
                                                      +/-
              小鼠，以 2∶1 的比例于前一天下午 6 点左右放到同
                                                                   A
              一个鼠笼中，次日早晨进行检栓，并将见栓母鼠内                                         346-1  346-2  346-3  346-4  346-5  346-6  DD  DD  346-1  346-2  346-3  346-4  346-5  346-6  DD  DD
              的胚胎记为 E0.5。分别在胚胎 E6.5（6 只）、E7.5                                                         —685 bp
                                                                    611 bp—
             （8 只）、E8.5（8 只）、E9.5（8 只）、E10.5（6 只）、E11.5
             （6只）取出母鼠子宫，剥离母体子宫外膜后，进行后
              续组织学分析。将解剖好的组织放至4%多聚甲醛
              中4 ℃过夜，脱水处理后包埋到石蜡中，并按一定方
                                                                             B
                                                                                1.5       **
              向切片。切片平均厚度为7 μm，于清水中展片后黏
                                                                                （TPM+1）
              附于载玻片上，放至37 ℃烘箱烘干。                                                1.0
                  组织切片观察采用苏木素和伊红（hematoxylin                                    0.5
              and eosin，HE）染色，首先在二甲苯中进行3次脱蜡，                                    lg
              然后用 100％→50%的乙醇进行梯度复水，苏木素                                          0    WT     Coq4 -/-
              染色 2 min，氨水反蓝 30 s，接着又用 50％→90％的                      A：Mouse genotype was identifed by PCR analysis. DD：double dis⁃
              乙醇进行脱水，伊红染色 3 min 后使用 100%乙醇脱                      tilled water. B：Coq4 TPM expression levels in WT and Coq4 placenta.
                                                                                                       -/-
                                                                 ** P < 0.01（n=6）.
              水后，放入二甲苯中短暂浸泡，长期保存可以使用
                                                                               图2 小鼠基因型鉴定
              中性树胶封片。                                                   Figure 2 Mouse genotype identification
              1.2.4 免疫荧光
                  对江苏省集萃药康生物有限公司来源繁育的6个                         2.2  Coq4敲除小鼠胚胎胎盘发育严重迟缓
              小鼠胚胎（WT 3个，Coq4 3个）组织脱蜡，进行柠檬                           对 Coq4 小鼠杂交后代进行基因型概率统计，
                                                                           +/-
                                    -/-
              酸钠抗原修复，PBS 清洗 4 次，免疫组化笔画圈，山                       发 现 F0 代 亲 本 产 生 的 F1 代 小 鼠 3 种 基 因
              羊血清室温封闭 1 h，Tpbpa（稀释比例为 1∶500）一                   型+/+、+/-、-/-的比值约为1∶2∶0，即未能从F1代鉴
              抗 4 ℃过夜。第 2 天取出恢复室温，PBS 清洗 4 次，                   定出 Coq4 基因型幼鼠，表明 Coq4 小鼠在出生前
                                                                                                -/-
                                                                         -/-
              对应二抗（稀释比例为1∶200）室温孵育1 h，甘油封                       已经死亡（表1）。
              片，放至-20 ℃冰箱等待拍片。                                       为了确定胚胎死亡的具体时间，对怀孕小鼠不
              1.3  统计学方法                                        同时期的胚胎进行解剖和基因分型。发现自 E7.5
                  统计分析与统计图均采用 Graphpad Prism 5 进                原 肠 胚 形 成 时 期 ，Coq4 外 胎 盘 椎（ectoplacental
                                                                                       -/-
              行计算与制作，数据以均值±标准差（x ± s）表示，两                       cone，epc）面积明显减少（图3A~C），胚胎大小与WT
              组数据的比较采用成组t检验，P < 0.05为差异有统                       小鼠胚胎相比差异显著（图3D~F）。
              计学意义。                                                  WT 小鼠胚胎 E8.5 时原肠胚形成结束，E9.5 时
                                                                胚胎回转，绒毛膜尿囊形成（图 4D）。与之相比，
              2  结 果
                                                                Coq4 组胚胎结构异常。呈现出与E8.5胚胎大小基
                                                                     -/-
                                                                                                       -/-
              2.1  Coq4敲除小鼠的基因型鉴定                               本一致的表型（图4E、F、图3K、L），且Coq4 小鼠胎
                  通过 PCR 实验鉴定小鼠胚胎的基因型，WT 胚                      盘出现了明显缺陷（图4B、C）。
              胎仅出现 1 条分子量为 685 bp 的条带，Coq4 胚胎                        E10.5 WT小鼠胚胎各器官开始形成，胎盘发育
                                                      -/-
              仅出现1条611 bp的条带，Coq4 胚胎出现685 bp及                   也趋近完整（图4G、J）。Coq4 胚胎出现明显器官发
                                          +/-
                                                                                          -/-
              611 bp 两个条带（图 2A）。根据条带出现情况可以                      育障碍，形态维持在原肠形成时期（图 4K、L），胎盘
              判断，346⁃2、346⁃4、346⁃6 号小鼠胚胎的基因型为                   缺失明显（图4H、I）。
              Coq4 ，346⁃3、346⁃5号小鼠胚胎的基因型是Coq4 ，                      同时将小鼠E7.5至E10.5胚胎连母体蜕膜同时
                                                          +/-
                  +/+
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