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第44卷第4期               贺雪珂，姜志胜，杨中州，等. Coq4基因全敲除小鼠胚胎发育的表型分析［J］.
                  2024年4月                     南京医科大学学报（自然科学版），2024，44（04）：462-468                       ·463 ·


                或提供电子或质子，并以氧化形式（泛醌）、还原形                           此为了研究 Coq4 的生理功能以及其缺失导致的致
                式（泛喹啉、泛醇）和自由基中间体（泛半醌自由基）                          病原因，本研究引进 Coq4 敲除小鼠模型，首次对其
                存在。CoQ10作为线粒体电子传递链中关键的电子                          表型进行研究。
                载体，可以将复合体Ⅰ和复合体Ⅱ的电子转移到复
                                                                  1  材料和方法
                合体Ⅲ，是细胞生物能量供应必不可少的组成成
                分。CoQ10还可以作为一种抗氧化剂参与连续的氧                          1.1  材料
                化还原反应，调控细胞内的氧化还原平衡 。                                  以 C57BL/6 为背景的 Coq4 全身杂合突变小鼠
                                                    ［3］
                                                                        +/-
                    辅酶Q生物合成蛋白4同系物（coenzyme Q bio⁃                （Coq4 ）分别从江苏省集萃药康生物有限公司
                synthesis protein 4 homolog ，COQ4）编码基因COQ4位      （B6/JGpt⁃Coq4 em2Cd3877 /Gpt）和剑桥⁃苏大基因组资源中
                于人类9号染色体34.13位点上。COQ4在人体所有组                       心［C57BL/6N⁃Coq4  tm1a（EUCOMM）Wtsi /Cmsu］获得（图1）。这
                                                         ［4］
                织中广泛表达，是CoQ10生物合成所必需的基因 ，其                        两种来源的 Coq4       +/- 小鼠分别杂交形成 Coq4 纯合
                突变可以引起多种与CoQ10相关的线粒体疾病                 ［5-7］ 。   （Coq4 ）胚胎和野生型（wild type，WT）胚胎基因一致。
                                                                       -/-
                    胎盘在胎儿出生前起着至关重要的作用，其发                              本研究所用动物均按照《南华大学小鼠福利和伦
                育缺陷会引起先兆子痫、胎儿生长受限、流产等多                            理条例》分笼饲养，喂养条件参照本课题组文献［14］，
                种妊娠相关并发症        ［8-9］ 。在哺乳动物发育早期，囊胚               具体为24 h明暗交替（明，8：00—20：00；暗，20：00—
                包含内细胞团（inner cell mass，ICM）和滋养外胚层                 8：00），环境温度（23±2）℃，相对湿度55％~60％，自
               （trophectoderm，TE） 。ICM 分化形成外胚层和原                  由饮食进水，定期更换垫料补充饲料以及饮水。
                                 ［10］
                始内胚层，产生胚胎和胚外组织。TE进一步发育成                           1.2  方法
                为极滋养外胚层（polar trophectodermal，pTE）和壁滋             1.2.1 杂交后代统计
                养外胚层（mural trophectodermal，mTE）。囊胚在植入                 采用江苏省集萃药康生物有限公司Coq4 小鼠
                                                                                                          +/-
                子宫内膜后，于胚胎日（embryonic day，E）6.5 d（E6.5）           （12 只）以及剑桥⁃苏大基因组资源中心 Coq4 小鼠
                                                                                                          +/-
                开始形成原肠胚，pTE 形成胚外外胚层                ［11］ 。原肠胚     （8只）作为F0代进行配繁，对出生1周龄的F1代小
                形成结束时胚外外胚层与胚外中胚层形成绒毛膜，                            鼠标记，并进行杂交后代概率统计并记录。
                并通过胚外体腔与外胚层分离。E8.5 时中胚层衍                          1.2.2 基因型鉴定
                生的尿囊附着并与绒毛膜基底层融合，经过绒毛膜                                剪取 0.2 cm 胚胎组织提取 gDNA，进行 PCR 分
                滋养层细胞的侵袭和分化，最终形成对母胎营养和                            析（P112-01，南京 Vazyme 公司）。使用引物序列
                气体交换至关重要与功能完全的胎盘                 ［12-13］ 。       （Coq4⁃WT⁃F：5′⁃CAGGATTCTCAGTTAGGGTATGT⁃
                    据报道，COQ4的研究主要集中在人类患者上，                        GC ⁃ 3′ ；Coq4 ⁃ WT ⁃ R：5′ ⁃ CACAACCTCTCCTAGC⁃
                目前还没有哺乳动物小鼠体内的相关研究，并且                             GATAAGGA⁃3′）从野生型等位基因中扩增685 bp的
                Coq4 基因突变的具体致病机制仍未完全清楚。因                          条带。使用引物序列（Coq4⁃KO⁃F：5′⁃GTCAGCTTC⁃

                         A
                                   1 2    FRT                loxP         FRT  loxP 3 4  loxP   5   7
                                                                                                  …
                                                   lacZ              neo
                                                                                                  …
                                            SA            pA             pA
                                         B
                                                            ATG
                                                                …          …
                                           Wild⁃type allele
                                                                …          …
                                                             1     4     5     7
                                                            ATG
                                                                …
                                           KO allele
                                                                …
                                                             1     4
                                                    CRISPR/Cas9  Uncoding region  Coding region
                   A：The targeted disruption strategy of mouse constructed by CAM⁃SU GRC. B：The targeted disruption strategy of mouse constructed by GemPhar⁃
                matech.
                                                   图1 小鼠Coq4基因的敲除策略
                                    Figure 1  The strategy of the targeted disruption of the mouse Coq4 gene
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