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第44卷第4期            钱鑫娜，朱文卿，邱 憬. 牛磺鹅去氧胆酸对兔实验性肠炎损伤的保护作用初探［J］.
                  2024年4月                     南京医科大学学报（自然科学版），2024，44（04）：475-482                       ·477 ·


                cDNA为模板进行RT⁃qPCR扩增。RT⁃qPCR反应条                     现配现用。每只兔称重，使用 0.05 mL/kg 盐酸赛拉
                件：预变性95 ℃ 30 s；40次循环95 ℃变性10 s，60 ℃               嗪肌肉注射，全身肌肉松弛后，俯卧位固定于手术
                退火 30 s；95 ℃变性 15 s，60 ℃退火 60 s，95 ℃变性            台。取兔一侧耳缘静脉注射，对照组注射 0.09%生
                15 s。以GAPDH作为内参，采用2           -ΔΔCt 法计算目的基        理 盐 水 1.5 mL，LPS 组 和 LPS+TCDCA 组 均 注 射
                因mRNA相对表达量。引物序列见表1。                               20 μg/mL LPS 溶液 10 μg/kg。术后第 2 天起，每 2 d
                                                                  喂食LPS+TCDCA组10 mg/L TCDCA溶液20 mL/kg，
                           表1 Real⁃time PCR引物序列
                   Table 1 Primer sequences used for real⁃time PCR  饮水喂药结束后其他时间自由进水，饮水喂药持续2周。
                                                                      饮水喂药2周后处死实验动物，观察肠道色泽、
                                                        Product
                 Gene        Primer sequence（5′→3′）               形态，取小肠中上段标本使用 4%多聚甲醛溶液固
                                                       size（bp）
                TNF⁃α  F：ATGTCTCAGCCTCTTCTCATTC          179      定，4 ℃冰箱中保存备用。
                       R：GCTTGTCACTCGAATTTTGAGA                   1.2.6  小肠组织石蜡切片染色观察组织病理变化
                IL⁃1β  F：CACTACAGGCTCCGAGATGAACAAC       145          肠道样本于 4%多聚甲醛中固定 48 h 后取出，
                       R：TGTCGTTGCTTGGTTCTCCTTGTAC
                                                                  流水冲洗过夜，自动组织脱水机脱水、石蜡包埋、全
                IFN⁃γ  F：CGCTTCGCTAAGACCCTGATGATG        212
                                                                  自动半薄轮转切片机切成 5 μm 薄片，分别使用 HE
                       R：GTGCTGTAGATGTCTCCGATGATGC
                                                                  染色试剂盒、阿尔新蓝⁃核固红染色试剂盒、PAS 染
                IL⁃10  F：TTCTTTCAAACAAAGGACCAGC          081
                                                                  色试剂盒染色，正置荧光显微镜下观察染色结果。
                       R：GCAACCCAAGTAACCCTTAAAG
                                                                  1.3 统计学方法
                CD80   F：AATTCAGGGTGGAAGAAAGGCTTGG       107
                                                                      所有数据均采用SPSS 23.0分析，计量资料以均
                       R：AATGAGAGAGACAGGTGGGGATGG
                CD206  F：GTCTGAGTGTACGCAGTGGTTGG         143      数±标准差（x ± s）表示，进行方差齐性检验，显示方
                       R：TCTGATGATGGACTTCCTGGTAGCC                差齐，两组间比较采用t检验，多组间进行单因素方
                GAPDH F：CAATACAGCTGCAGCAGTTAC            105      差分析和 SNK 多重比较，P < 0.05 为差异有统计学
                       R：AGGCTAATTCCTGCCGAAATA
                                                                  意义。
                   F: forward；R：reverse.
                                                                  2 结    果
                1.2.4  Western blot 检测巨噬细胞炎症相关蛋白水
                平和NF⁃κB信号通路的活性                                    2.1  细胞毒性实验
                    细胞培养同前。使用含1% PMSF的RIPA缓冲                          探究 TCDCA 对巨噬细胞活性的影响，筛选
                液提取总蛋白，使用 BCA 蛋白质测定试剂盒定量。                         TCDCA 的适宜浓度。MTT 法检测不同浓度 TCDCA
                提取的蛋白质样品通过 10% SDS⁃PAGE 分离、转移                     溶 液（0、0.1、1.0、10.0、100.0 μmol/L）刺 激 4 h 后
                到PVDF膜、快速封闭液中封闭1 h、4 ℃下与一抗杂                       Raw264.7巨噬细胞的细胞活性。如图所示，TCDCA
                交过夜，TBST 漂洗 3 次，加二抗室温孵育 1 h，TBST                  组中，与0、0.1、10.0、100.0 μmol/L TCDCA溶液相比，
                漂洗 3 次。加入 ECL 化学发光试剂，使用多功能                        1.0 μmol/L TCDCA 溶液刺激下，Raw264.7 显示较高
                化学发光凝胶成像系统检测内参 GAPDH、炎症相                          的细胞活性。LPS+TCDCA组在LPS刺激2 h后更换
                关蛋白（IL⁃1β和 IL⁃6）、NF⁃κB 信号通路相关蛋白                   为含不同浓度TCDCA的培养基。如图1所示，综合
               （p⁃IκBα、ΙκBα、p⁃p65 和 p65）的表达水平。使用                  考虑两组实验结果，当 TCDCA 浓度为 1.0 μmol/L
                Image J 软件定量分析蛋白条带灰度值并计算相对                        时，细胞呈现较高的活性，故选取该浓度作为后续
                表达水平。                                             细胞实验的工作浓度。

                1.2.5  动物实验操作                                     2.2  TCDCA降低Raw264.7细胞中炎症相关细胞因
                    所有动物实验均经南京医科大学实验动物伦                           子的表达水平
                理委员会批准，批准文号：IACUC⁃2303028。实验                          采用RT⁃qPCR和Western blot检测细胞中促炎和
                用新西兰白兔12只，体重（2.5±0.2）kg，适应性饲养                     抗炎因子的基因表达，探究TCDCA是否能够缓解LPS
                1 周，均采用单笼饲养，自由进食。12只新西兰白兔                         刺激下的炎症反应。肿瘤坏死因子⁃α（tumor necrosis

                分 3 组：空白组、LPS 组、LPS+TCDCA 组。术前 24 h               factor⁃α，TNF⁃α）、IL⁃1β和干扰素⁃γ（interferon⁃γ，
                实验动物禁食。实验开始前配制 0.09%生理盐水、                         IFN⁃ γ）为 促 炎 因 子 ，白 介 素 ⁃10（interleukin⁃10，
                20 μg/mL LPS溶液、10 mg/L TCDCA 溶液，所有溶液              IL⁃10）为抗炎因子，CD80 是巨噬细胞 M1 型极化的
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