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第44卷第4期
               ·476 ·                            南 京    医 科 大 学 学         报                        2024年4月


              and the secretion of acidic as well as neutral mucins in the LPS+TCDCA group increased compared with those in the LPS group.
              Conclusion：TCDCA alleviates intestinal tissue inflammation and reduces intestinal inflammatory damage caused by LPS by
              decreasing the expression of inflammatory factors.
             ［Key words］ taurochenodeoxycholic acid；intestinal damage；macrophages；lipopolysaccharide
                                                                            ［J Nanjing Med Univ，2024，44（04）：475⁃482］






                  肠道炎症性疾病以反复发作的急慢性炎症为                           acid⁃Schiff，PAS）染色试剂盒（上海碧云天生物技术
                                ［1］
              特点，发病机制多样 。然而，目前临床上针对该疾                           有限公司），白介素⁃1β（interleukin⁃1β，IL⁃1β）抗
              病的常用药物疗效有限，多有不良反应                  ［2-3］ ，治疗的     体、白介素⁃6（interleukin⁃6，IL⁃6）抗体、p65 抗体、
              规范化标准尚未建立。                                        p⁃p65 抗体、ΙκBα抗体、p⁃ΙκBα抗体（CST 公司，美
                  化学试剂、基因敲除和转基因动物诱导的肠                           国），GAPDH 抗体（武汉三鹰技术有限公司），山羊
              道炎症模型在科学研究中应用广泛，其中脂多糖                             抗兔IgG、山羊抗小鼠IgG（北京中杉金桥公司）。
             （lipopolysaccharide，LPS）是诱导炎症的常用实验试                1.2  方法
              剂 ［4-5］ 。LPS 是革兰氏阴性菌外壁层的重要化学成                     1.2.1  Raw264.7巨噬细胞培养
              分之一，是炎症的有效激活剂 。牛磺鹅去氧胆酸                                 Raw264.7巨噬细胞在含有1%青霉素/链霉素和
                                         ［6］
             （taurochenodeoxycholic acid，TCDCA）是鹅去氧胆酸           10%胎牛血清的 DMEM 高糖培养基中培养，并在
                                                    ［7］
              的牛磺酸偶联形式，是一种结合型胆汁酸 。牛磺                            5% CO2加湿培养箱中于37 ℃下生长，按规定更换培
              熊去氧胆酸和熊去氧胆酸已被证实可改善肠道屏                             养基。
                                               ［9］
              障功能障碍 和调节肠道微生物平衡 。已有研究                            1.2.2  细胞毒性实验
                        ［8］
              发现，TCDCA可通过多种信号通路调节炎症反应与                               实验分为 TCDCA 组和 LPS+TCDCA 组。在 96
              免疫功能    ［10-11］ ，具有治疗肠道炎症的潜在价值。因                  孔板中接种 Raw264.7 巨噬细胞（5×10 个/孔），培养
                                                                                                  3
              此，本研究构建体内外炎症模型，评估 TCDCA 对                         箱中培养24 h后，TCDCA组加入不同浓度的TCDCA
              LPS 诱导的肠道炎症的影响及作用机制，以探索                           溶液（0、0.1、1.0、10.0、100.0 μmol/L）刺激 4 h，LPS+
              TCDCA在治疗急慢性肠道炎症中的作用。                              TCDCA组先加入含100 mg/mL LPS的完全培养基培
                                                                养 2 h，后将培养基更换为上述含梯度浓度 TCDCA
              1 材料和方法
                                                                的完全培养基继续培养 4 h。后续实验步骤两组一
              1.1  材料                                           致，均为刺激结束后将培养基替换为含 10 μL MTT
                  Raw264.7巨噬细胞（中国科学院上海细胞库），                     溶液的 100 μL 新鲜培养基，37 ℃孵育 4 h。每孔加
              DMEM 高糖培养基、胎牛血清、青霉素/链霉素双抗                         入100 μL Formazan溶解液、混匀、37 ℃孵育4 h。使
              溶液（Gibco 公司，美国），TCDCA（纯度>98%；上海                   用微孔板分光光度计测量波长490 nm处的吸光度，
              麦克林生化科技股份有限公司），LPS（Sigma⁃Aldrich                  每组设3个重复孔。
              公司，美国），TRIzol（Invitrogen Carlsbad公司，美国），          1.2.3  定量实时聚合酶链反应（RT⁃qPCR）检测巨噬
              Prime Script RT Master Mix、SYBR Premix ExTaq Ⅱ    细胞炎症相关mRNA的表达
             （TaKaRa 公司，日本），PVDF 膜（Millipore 公司，美                    Raw264.7巨噬细胞接种于6孔板（1×10 个/孔），
                                                                                                       5
              国），RIPA 缓冲液、快速封闭液、ECL 化学发光试剂                      培养24 h后，对照组更换新鲜培养基，LPS组更换含
              盒（苏州新赛美生物科技有限公司），实验用新西兰                           100 mg/mL LPS 的完全培养基，LPS+TCDCA 组更换
              白兔（邳州市东方养殖有限公司），盐酸赛拉嗪（陆                           上述含 100 mg/mL LPS 的完全培养基刺激 2 h，PBS
              眠宁；吉林省华牧动物保健品公司），4%多聚甲醛                           漂洗3遍，更换含1 μmol/L TCDCA 的完全培养基培
              溶液（北京兰杰柯科技有限公司），苏木精⁃伊红                            养 4 h。根据制造商的说明使用 TRIzol 试剂从细
             （hematoxylin⁃eosin，HE）染色试剂盒（南京建成生物                 胞中提取总 RNA，然后使用 Prime Script RT Master
              工程研究所），MTT溶液、BCA蛋白质测定试剂盒、阿                        Mix 逆转录成互补 DNA（cDNA）。然后使用 SYBR

              尔新蓝⁃核固红染色试剂盒、过碘酸⁃雪夫（periodic                      Premix ExTaq Ⅱ 和 QuantStudio TM  7 Flex System 以
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