Page 18 - 南京医科大学自然版
P. 18

第44卷第5期
               ·606 ·                            南 京    医 科 大 学 学         报                        2024年5月


              器上海有限公司）；JY92⁃IIN 型高速冷冻离心机（湖                      对照组及模型组为假给药，给予等剂量的溶剂，于
              南湘仪离心机仪器有限公司）；冻干机（东京理化器                           末次造模3 h后取材。
              械株式会社，日本）；SCIENTZ⁃48L 型高通量组织研                              表1   惊厥发作评级标准（拉辛量表）
              磨器（宁波新芝生物科技有限公司）；Epoch 2型酶标                        Table 1  Convulsive seizure rating criteria（Racine scale）
              仪（BioTek 公司，美国）；倒置光学显微镜（奥林巴斯                         Seizure grade      Behavioral manifestations
              公司，日本）；超高效液相色谱仪 Dionex Ultimate                          0         no convulsive seizures
              3000（Thermo Fisher 公司，美国）；静电场轨道阱高                        1         rhythmic mouth or facial twitching，and

              分 辨 质 谱 仪（Thermo Fisher 公 司 ，美 国）；Waters                           disorienting seizures
                                                                       2         indirect nodding or tail wagging
              ACQUITY UPLC C18 柱 2.1 mm × 100 mm，1.7 μm
                                                                       3         single⁃limb jerky，and clonic seizures
             （Waters 公司，美国）；台式高速冷冻离心机 H1750R
                                                                       4         multiple limb twitching or tonus，torsion
             （湖南湘仪公司）。
                                                                                 and somersaulting
              1.1.2  试剂
                                                                       5         generalized ankylosis or death
                  羧甲基纤维素钠购自麦克林公司（J1204A）；
              VPA购自上海源叶生物科技有限公司（S60377）；CA                      1.2.2  大鼠惊厥行为学观察
              和DCA购自美仑生物公司（O1025A，J0102A），肿瘤                         每次造模时均由两位观察人员负责记录各组
              坏死因子α（tumor necrosis factor α，TNF⁃α）、白介素          大鼠的惊厥发作时间、惊厥结束时间、惊厥发作等
              6（interleukin 6，IL⁃6）、IL⁃1β检测试剂盒均购自睿              级，并计算惊厥持续时间。当大鼠出现不自主仰头
              信 生物科技有限公司（RX302058R、RX302856R、                   动作或肢体抽动时便视为惊厥发作，大鼠从进入水
              RX302869R）；大鼠谷氨酸（glutamate，Glu）和γ⁃氨基              中开始到惊厥发作的时间即为惊厥潜伏期。大鼠
              丁酸（γ⁃aminobutyricacid，GABA）检测试剂盒购自江苏              最后一次身体抽搐停止的时间即为惊厥结束时
              酶免生物科技有限公司（MM⁃0601R1、MM⁃0441R1）。                  间。从大鼠惊厥发作到惊厥结束的时长便为惊厥
              1.1.3  动物                                         持续时间。
                  3周龄的雄性SD大鼠，体重约（50±5）g，购自广                     1.2.3  大鼠血清及海马组织中TNF⁃α、IL⁃6和IL⁃1β
              东省医学实验动物中心，经检验合格后饲养于 SPF                          含量检测
              级实验室，室温22~24 ℃，湿度60%，12 h明暗交替，                         将大鼠麻醉后，腹主动脉取血。室温下静置1 h，
              自由饮食饮水。本研究获得广东药科大学动物保                             4 ℃，3 000 r/min 离心 15 min，吸取上清按照 ELISA
              护伦理委员会的批准（动物伦理编号：D202402⁃8）。                      试剂盒说明书进行检测。
              1.2  方法                                                将大鼠处死后，在冰上快速分离出海马组织，
              1.2.1  动物分组与模型建立                                  按照 1∶9 的重量体积比，将海马组织称重后加入对
                  SD大鼠经过适应性喂养后随机分为对照组、模                         应体积预冷的生理盐水，加入磁珠，在组织匀浆机
              型组、VPA组（189 mg/kg）、CA组（60 mg/kg）、DCA组             中3 000 r/min匀浆20 s，3次。最后在高速离心机中
             （60 mg/kg），各给药组均以0.5%羧甲基纤维素钠为溶                     4 ℃ 12 000 r/min 离心 30 min，吸取上清按照 ELISA
              剂，每组 9 只。VPA、CA 和 DCA 剂量参照国内外研                    试剂盒说明书进行检测。
              究 ［8-11］ 。                                        1.2.4  大鼠海马组织中Glu和GABA含量检测

                  除对照组外，各组大鼠均置于装有（45.0±0.5）℃                         于-80 ℃冰箱取出分装的海马组织，按照 1∶9
              热水的容器中进行造模，水位以大鼠在水中站立刚                            的重量体积比，加入对应体积预冷的生理盐水，以
              好露出头部为宜。根据不同分组分别进行造模和                             3 000 r/min 20 s，进行3次组织匀浆，4 ℃ 12 000 r/min
              给药，每2 d热水浴1次，在连续8次热水浴后，根据                         离心 30 min 后，吸取海马组织上清液按照 Glu 和
              各组惊厥表现、各项指标及文献报道情况，综合考                            GABA试剂盒说明书进行测定。
              察造模情况，造模方法参照文献［12-13］。大鼠在                         1.2.5  苏木精⁃伊红（hematoxylin⁃eosin，HE）染色观
              造模 5 min 后或惊厥发作后立即离水，由两位观察                        察海马神经元病理损伤
              人员记录大鼠惊厥行为学情况，并根据拉辛量表                       ［14］       大鼠处死后，断头取脑组织，放入 4%多聚甲醛
             （表 1）对大鼠惊厥发作行为的严重程度进行评分。                           中固定 24 h，梯度酒精脱水，浸蜡，石蜡包埋后切成
              每次造模前1 h灌胃给药，次日不造模亦正常给药，                          厚4 μm的薄片，HE染色，脱水，使用中性树胶封片，
   13   14   15   16   17   18   19   20   21   22   23