Page 48 - 南京医科大学自然版
P. 48

第44卷第5期
               ·636 ·                            南 京    医 科 大 学 学         报                        2024年5月


              体生存率）的影响。                                         化后重悬并计数，调整细胞密度至 5×10 个/mL，
                                                                                                       4
              1.2.3 RNA干扰实验                                     取细胞悬液 200 μL加入Transwell小室。24 孔板下
                  培养 KYSE⁃150 细胞，按照 si⁃CTAGE15 干扰说              室加入 600 μL 含 10%胎牛血清的培养基，放入
              明书在转染前1 d按4×10 个/孔接种6孔板，待细胞                       37 ℃、5% CO2培养箱培养48 h。然后取出Transwell
                                     5
              生长至70%~80%时采用Lipo⁃ fectamine 3000试剂               小室，弃去孔中培养液，用棉签轻轻擦掉上层未迁
                                                 TM
              盒进行转染，转染后48 h收获细胞用于细胞实验和                          移细胞，PBS洗3遍，甲醇固定20 min。随后用0.1%
              qRT⁃PCR。si⁃CTAGE15 序列如下：siRNA1⁃F，5′⁃              结晶紫染色30 min，PBS洗3遍。相差显微镜下随机
              ACAAAUAGCUGAAGCCAAATT⁃3′；siRNA1⁃R，5′⁃             选择5个视野观察细胞并计数。
              UUUGGCUUCAGCUAUUUGUTT⁃3′。siRNA2⁃F，5′⁃             1.2.8 细胞侵袭实验
              GCUUAGAAGGAGAAAGAAATT⁃3′；siRNA2⁃R，5′⁃                  将 Matrigel 基质胶 1∶20 稀释，包被 Transwell 小
              UUUCUUUCUCCUUCUAAGCTT⁃3′。siRNA3⁃F，5′⁃             室底部膜的上室面，置 37 ℃ 6 h，使 Matrigel 基质胶
              AAACAAAGGAAGAGCUUACTT⁃3′；siRNA3⁃R，5′⁃             聚合成凝胶。使用前进行基底膜水化。将处于对
              GUAAGCUCUUCCUUUGUUUTT⁃3′。阴性对照：F，                  数生长期的 KYSE⁃150 细胞胰酶消化后重悬计数，
                                                                                     5
              5′ ⁃ UUCUCCGAACGUGUCACGUTT ⁃ 3′ ；R：5′ ⁃ AC⁃       调整细胞密度至 2×10 个/mL，取细胞悬液 100 μL
              GUGACACGUUCGGAGAATT⁃3′。                           加入 Transwell 小室。24 孔板下室加入 600 μL 含

              1.2.4 qRT⁃PCR                                     10%胎牛血清的培养基，放入37 ℃、5% CO2培养箱
                  使 用 TRIzol 从 培 养 的 KYSE ⁃ 150、KYSE ⁃ 30、      培养48 h。然后取出 Transwell 小室，弃去孔中培养
              KYSE⁃410、TE⁃1 细胞及 HEEC 细胞中提取 RNA，                 液，用棉签轻轻擦掉 Matrigel 基质胶及上层未侵入
              Prime Script RT Master Mix 反转录试剂盒将 1 ng           细胞，PBS 洗 3 遍，甲醇固定 20 min。0.1%结晶紫
              RNA 逆转成 cDNA，并按照 qRT⁃PCR 反应体系配制                   染色 20 min，PBS 洗 3 遍。显微镜下随机选择 5 个
              反应溶液。使用 Nanodrop 2000/2000 C 分光光度计                视野观察细胞并记数。
              测量 RNA 的浓度。用荧光定量 PCR 试剂盒在 ABI                     1.3  统计学方法
              StepOnePlus 实时 PCR 系统上进行 qRT⁃PCR 实验，                   使用 SPSS 22.0 统计软件，计量资料采用均数±
                         TM
              方法同1.2.2。                                         标准差（x ± s）表示，两组间比较采用 Student’s t 检
              1.2.5 细胞划痕实验                                      验分析，3 组之间比较采用单因素方差分析或 Dun⁃
                  先用黑色记号笔在 6 孔板背面每隔大约0.7 cm                     nett⁃t检验。计数资料采用频数（百分比）表示，统计
                                                   5
              划横线，每孔划3条横线。每孔加入5×10 个KYSE⁃                       分析采用卡方检验。生存风险比例采用 COX 单因
              150细胞。第2天用200 μL枪头垂直于背后的横线                        素回归模型分析，生存分析选用 Kaplan⁃Meier（log⁃
              划痕。用PBS洗细胞3次，清除划下的细胞，加入无                          rank）分析，图片使用 GraphPad Prism 8 软件绘制，
              血清培养基，放入37 ℃、5% CO2培养箱培养。按 0、                     P < 0.05为差异有统计学意义。
              48 h时间点拍照。
                                                                2  结 果
              1.2.6 细胞增殖实验
                  平板克隆实验：取对数期 KYSE⁃150 细胞做梯                     2.1  TCGA 数据库中 CTAGE15 与食管鳞癌预后的
              度稀释，6孔板每孔种3 000个细胞，培养约2周后从                        关系
              培养箱中取出，PBS 清洗 2 遍，每孔加入 1 mL 甲醇                         通过TCGA 数据库下载数据，按照CTAGE15表
              固定 20 min 后弃甲醇，每孔加入 1 mL 结晶紫染色                    达量中位数将 ESCC 患者分为高表达和低表达两
              20 min，PBS洗2遍，晾干后用核酸凝胶成像仪拍照，                      组，Kaplan⁃Meier 生存法分析总体生存期和疾病特

              观察克隆大小，计数超过50个克隆的数量。CCK⁃8                         异性生存期发现，CTAGE15 表达与 ESCC 患者生存
              实验：将细胞按照实验设计要求接种于 96 孔板中，                         期相关，高表达组患者生存期较长（图 1A、B，P <
              每组设置 3 个复孔，每孔接种 3 000 个细胞，分别                      0.05）。卡方分析表明，CTAGE15 在 ESCC 中的表达
              在 24、48、72 h 按照 CCK⁃8 试剂盒说明书检测各组                  与肿瘤 T 分期显著相关，GTAGE15 高表达患者 T 分
              细胞450 nm处的吸光度值。                                   期相对更早（表1，P < 0.05），进一步单因素Logistics
              1.2.7 细胞迁移实验                                      回归分析也与上述结果一致，CTAGE15与肿瘤T分
                  将处于对数生长期的 KYSE⁃150 细胞胰酶消                      期显著相关（表2，P < 0.05）。
   43   44   45   46   47   48   49   50   51   52   53