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第44卷第5期
               ·682 ·                            南 京    医 科 大 学 学         报                        2024年5月


                                       ［3］
              或Ⅲ期CRC患者在术后复发 。当前精准医学高速                          （北京天根公司）操作。收集的DNA样品使用分光光
              发展，依靠传统指标（如癌胚抗原）预测肿瘤复发灵                           度计测定吸光率并计算浓度，分装后在-80 ℃冰箱保
              敏度及特异度均较低，亟需新的标志物为临床医生                            存待用。
              提供信息以精准识别术后复发的高危患者。                               1.2.3  实时定量荧光 PCR（qRT⁃PCR）检测 mtDNA
                  线粒体是进化上相对保守的细胞器，具有独特                          含量
              的生物学特征，在调节代谢、调节细胞周期、能量产                                采用 20 μL PCR 反应体系（Q321⁃02/03，南京
              生、细胞凋亡和细胞衰老中发挥重要作用 。线粒                            Vazyme 公司）：2×Mix 10 μL，正向引物（10 μmol/L）
                                                    ［4］
              体 DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）为 不 同 于 核           0.4 μL，反向引物（10 μmol/L）0.4 μL，DNA模板10 ng，
              DNA 的双链环状 DNA，携带的 37 个编码基因是维                      ddH20 补至 20 μL。置于 Cobas Z PCR 仪依照程序：
                                             ［5］
              持线粒体、细胞正常功能所必需的 。目前 mtDNA                         95 ℃，30 s；95 ℃，10 s；60 ℃，30 s；40 个循环。反应
              在肿瘤相关研究中更多围绕DNA序列变异展开，关                           结束后读取Ct值，以3个平行复孔计算平均值。
                                        ［6］
              于 DNA 含量的研究尚不多见 。尽管 mtDNA 含量                      1.2.4 mtDNA引物及含量计算方法
              变化受多种遗传、组织环境等因素影响，但这也可                                 便于科学合理计算 mtDNA 相对于核 DNA 的含
                                                                                    ［8］
              能意味着线粒体功能障碍，并在肿瘤、线粒体疾病、                           量，本文参考文献方法 并进行了适当修改。通过
                                                  ［7］
              抑郁症、糖尿病等疾病中发挥重要作用 。mtDNA                          相对定量法，即将线粒体16 S rRNA基因（MT⁃RNR2
              含量与CRC患者预后的关系鲜有报道。因此，本研                           基因）扩增水平作为 mtDNA 含量指标，将 HemoG 基

              究收集 117 例 CRC 患者新鲜组织标本，分析 mtDNA                   因扩增水平作为核 DNA 含量指标，将每个样品的
              含量与CRC临床病理特征及患者预后的相关性。                            mtDNA 含量指标除以 HemoG 扩增水平以校正组织
                                                                间差异。该比值被当作组织 mtDNA 相对含量。计
              1  对象和方法
                                                                算公式为 2     -ΔCt ，ΔCt=（MT-RNR2 基因 Ct 值-HemoG
              1.1  对象                                           基 因 Ct 值 ）。 引 物 序 列 ：HemoG，正 向 ：5′ ⁃
                  选取2018年1月—2020年6月在南京医科大学                      GAAGAGCCAAGGACAGGTAC⁃3′，反向：5′⁃CAACT⁃
              第二附属医院行手术治疗的117例CRC患者。纳入                          TCATCCACGTTCACC⁃3′；MT⁃RNR2，正向：5′⁃ GCC⁃
              标准：①术后病理确诊为腺癌；②患者知情同意且                            TTCCCCCGTAAATGATA ⁃3′，反向：5′⁃ TTATGCGA⁃
              依从性好；③初次诊断且术前未行新辅助放化疗。                            TTACCGGGCTCT ⁃3′。
              排除标准：①合并其他恶性肿瘤或免疫系统疾病；②                           1.3  统计学方法
              随访资料缺失或失访；③急诊手术；④非复发/死亡因                               采用SPSS 24.0统计软件、GraphPad Prism 8.0进
              素而术后辅助治疗中断。本研究经过本院伦理委员                            行数据分析及作图。mtDNA含量不符合正态分布，
              会批准（编号：［2021］⁃KY⁃048⁃01），并知情同意。                   以中位数（四分位数）［M（P25，P75）］表示。癌与癌旁
              1.2  方法                                           组织间 mtDNA含量比较采用Wilcoxon秩和检验，两
              1.2.1 临床资料                                        组间mtDNA含量比较采用 Mann⁃Whitney U检验，多
                  收集患者一般临床资料，包括年龄、性别、肿瘤                         组间比较使用Kruskal⁃Wallis检验。采用受试者工作
              位置、肿瘤大小、病理分化、大体类型、DNA 错配修                         特 征（receiver operating characteristic，ROC）曲 线 、
              复（mismatch repair，MMR）状态、KRAS 基因突变情               ROC曲线下面积（area under curve，AUC）判断mtDNA
              况、BRAF基因突变情况、T分期、N分期、TNM分期。                       含量预测价值，使用约登指数计算公式（灵敏度+特
              117例中，男70例，女47例。TNM分期中，Ⅰ期31例，                     异度-1）计算最佳截断值。DFS 生存曲线绘制采用
              Ⅱ期34例，Ⅲ期52例。随访3年内出现影像学上明                          Kaplan⁃Meier 检验。采用单因素和多因素 Cox 回归
              确局部复发或远处转移定义为肿瘤复发，采用无病                            分析DFS相关危险因素。P < 0.05为差异有统计学
              生存期（disease free survival，DFS）进行评价。               意义。
              1.2.2 组织DNA的提取
                                                                2  结 果
                  手术时，从肿瘤边缘切取肿瘤组织，癌旁组织
              从距离肿瘤2 cm处获取。所获组织均由液氮保存，                          2.1 癌组织及癌旁组织mtDNA含量比较
              每个样本提取时取适量并碾碎。将碾碎后的组织                                  在收集的 117 例 CRC 组织样本中，提取组织
              放于 1.5 mL EP 管中，按照 DNA 抽提试剂盒说明书                   DNA 并计算癌组织中的 mtDNA 含量以及相对应癌
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