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第44卷第7期          苏思璇，尚彦星，段程伟，等. 基于生信分析对脓毒症相关性脑病中神经炎症相关核心基因
                  2024年7月                 的筛选［J］. 南京医科大学学报（自然科学版），2024，44（7）：915-926                    ·917 ·


                001，Lonsera公司，美国）；DMED培养基（C11995500BT，            块均采用模块特征基因（moduleEigengenes，ME）
                Gibco公司，美国）；青霉素⁃链霉素溶液（C0222，上海                    表示，代表给定模块内基因表达谱的合成基因。
                碧云天公司）；胰蛋白酶⁃EDTA 消化液（25200⁃056，                   1.2.3 筛选差异表达基因（differentiallyexpressed gene，
                Gibco 公司，美国）；TRIzol（15596018，Ambion 公司，           DEG）
                美 国 ）；PrimeScript TM  RT Master Mix（Perfect Real      采用 Limma R 包从 GSE103156 数据集中筛选
                                                            TM    LPS 刺激前后小胶质细胞的 DEG，计算每个 DEG 的
                Time）（RR036A，TaKaRa 公 司 ，日 本）；BeyoFast
                SYBR Green qPCR Mix（D7262，上海碧云天公司）；               P 值，在校正调整后筛选条件设定为 P < 0.05 和
                蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂（Roche 公司，美国）；                       |log2FC|>0.5 ［11］ 。Log2FC>0.5表示该基因的表达水平

                BCA 蛋白检测试剂盒（23225，Thermo Fishier Scien⁃           升高，而 log2FC<-0.5 则表示该基因的表达水平下
                tific 公 司 ，美 国）；组 蛋 白 去 乙 酰 化 酶 9（histone         降，并绘制火山图将所得结果可视化。
                deacetylase 9，HDAC9）抗体（SC⁃398003，Santa Cruz       1.2.4  基因本体论（gene ontology，GO）、京都基因与
                公司，美国）；IL⁃1β抗体（ab9722）、诱导型一氧化氮                    基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and
                合 酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）抗 体      genomes，KEGG）功能富集分析
               （ab178945，Abcam 公 司 ，美 国 ）；p ⁃ STAT3 抗 体               GO 法将 DEG 从生物过程（biological process，
               （9145S，CST公司，美国）；STAT3抗体（10253⁃2⁃AP，               BP）、细胞成分（cellular component，CC）、分子功能
                Proteintech 公司，美国）；p⁃JAK1 抗体（3331，CST 公          （molecular function，MF）3 个层面进行基因功能注
                司，美国）；JAK1 抗体（66466⁃1⁃Ig）、α⁃tubulin 抗体            释。采用 Clusterprofiler 包  ［12］ 进行 GO 功能富集分
               （66031⁃1⁃Ig）（Proteintech 公司，美国）；二抗（Jackson         析，得到模块基因所富集到的 GO terms 及 GO terms
                Immuno Research公司，美国）；PCR引物由南京擎科                  的P值；以校正后P < 0.05为纳入标准，筛选出差异
                生物公司合成。HDAC9 过表达慢病毒载体由蔚楠                          表达基因显著富集的 GO terms，并进行可视化。运
                生物科技股份有限公司构建。小鼠小胶质细胞株                             用 Clusterprofiler 包将筛选的模块基因或 DEG 进行
                BV2购于上海富衡生物科技有限公司。                                KEGG 通路富集分析，以校正后 P < 0.05 为纳入标
                1.2  方法                                           准，筛选出显著富集的信号通路并进行可视化。
                1.2.1 在线数据获取                                      1.2.5 Lasso回归分析
                    NCBI⁃GEO（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）数       使用“glmnet”和“Lambda”R 包进行 Lasso 回归
                据库中输入 SAE、Spesis、LPS 等关键词搜索到符合                    分析  ［13］ 。Lambda 最小值取 0.000 时的模型为最佳
                研 究 的 数 据 集 GSE65682 和 GSE103156。 其 中 ，           诊断模型。在系数路径图中，随着 log（Lambda）的
                GSE65682 数据集基于 GPL13667 芯片分析平台，由                  降低，模型的系数逐渐收敛，在交叉验证偏差图
                         ［9］
                Scicluna等 于2015年提交，本研究纳入该数据集中                     中，寻找使得模型偏差最小化的 Lambda 值。选择
                75例健康或非感染人群对照样本、727例重症监护室                         最小 Lambda 值对应模型后，利用 R 语言中 Random
                的脓毒症患者血液样本测序数据；GSE103156数据集                       Forest 包进行筛选，通过考虑各个基因的重要性得
                基于 GPL17400 芯片分析平台，由 Mazzio 等            ［10］ 于   分 ，识 别 出 对 模 型 预 测 性 能 贡 献 最 大 的 DEG。
                2017年提交，本研究纳入该数据集中BV2小胶质细                         Lasso 分析的基因被认为是 SAE 神经炎症的候选枢
                胞 LPS 刺激组（n=3）以及非刺激对照组（n=3）测序                     纽基因。
                数据。                                               1.2.6  蛋白质⁃蛋白质相互作用网络（protein⁃protein

                1.2.2  加权基因共表达网络分析（weighted gene co⁃              interaction network，PPI）构建及核心基因分析
                expression network analysis，WGCNA）                    将获得的交集基因输入到 STRING11.5（https：//
                    采用 WGCNA 包对脓毒症 GSE65682 数据集构                  string⁃db.org）数据库中构建PPI网络，设置蛋白种类
                建WGCNA网络。将基因表达矩阵转化为Person系                        为“Homo sapiens”，相互作用阈值为0.7，获取蛋白相
                数矩阵，计算软阈值使 Person 系数矩阵符合无尺度                       互作用信息，分析结果保存为 TSV 文件，将其导入
                网络分布，进一步转变为邻接矩阵，计算节点之间                            Cytoscape3.7.2软件，利用Network Analyzer工具计算
                相异系数，并据此构建分层聚类树。删除离群值后                            节点属性，筛选出前十核心基因。
                分析挖掘基因共表达模块并拟合，引入表型相关信                            1.2.7 小胶质细胞培养及活化模型构建
                息并识别与脓毒症表型相关的关键模块。所有模                                 BV2 细胞于 DMEM 完全培养基（含 10%胎牛血
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