Page 34 - 南京医科大学自然版

第44卷第7期
·918 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2024年7月

清、1%青霉素⁃链霉素），37 ℃、5% CO2条件培养箱 进行目标细胞筛选，采用 Western blot 检测 HDAC9
中培养。BV2 细胞传代平均接种于培养皿中，待生 过表达效率。
长至合适密度，加入LPS（1 μg/mL）刺激0 h、24 h，收 1.2.9 实时荧光定量PCR（quantitative real⁃time PCR，
集细胞用于后续实验。 RT⁃qPCR）
1.2.8 BV2小胶质细胞体外HDAC9慢病毒过表达 采用 TRIzol 法提取细胞总 RNA，采用 Prime⁃
以HDAC9过表达慢病毒载体（oe⁃HDAC9）感染 Script RT Master Mix 试 剂 盒 将 mRNA 逆 转 录 至
TM
BV2 小胶质细胞，以空白慢病毒载体（oe⁃ctrl）作为 cDNA，采用SYBR Green qPCR试剂盒进行RF⁃qPCR，
对照，分别加入滴度为 1×10 病毒液和终浓度为 反应条件：95 ℃ 52 min 预变性；95 ℃ 15 s 变性，
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10 μg/mL polybrene培养24 h后换液，继续培养 48 h， 60 ℃ 30 s 退火/延伸，重复 40 个循环；4 ℃保存。以
之后采用含嘌呤霉素（终浓度 10 μg/mL）的培养基 Gapdh作为内参，引物序列具体信息见表1。

表1 RT⁃qPCR基因引物序列信息
Table 1 Sequences of gene primers for RT⁃qPCR
Gene Species Forward（5′→3′） Reverse（5′→3′）
Gapdh mouse CAAGGTCATCCATGACAACTTTG GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG
Il⁃1β mouse TCATTGTGGCTGTGGAGAAG AGGCCACAGGTATTTTGTCG
Tnf⁃α mouse ACAGAAAGCATGATCCGCGA TTGCTACGACGTGGGCTAC
Hdac9 mouse GCGGTCCAGGTTAAAACAGAA GCCACCTCAAACACTCGCTT
Lrrc25 mouse GAACTAGGTTGCTGTGGTTATGT GTCTGAGTCCAGTCTACCCTG
Gpr183 mouse ATGGCTAACAATTTCACTACCCC ACCAGCCCAATGATGAAGACC
Nadk mouse TCATGGGGATGAGACCTGGAG ACAAGCACACTCTTGGGAGAC
Inos mouse CAAGAGTTTGACCAGAGGACC TGGAACCACTCGTACTTGGGA

1.2.10 Western blot 值（图 1A），同时保证了较高的连通性（图 1B）。计
提取细胞蛋白，采用BCA法检测蛋白浓度。根 算基因间的相关性矩阵和拓扑重叠矩阵（topologi⁃
据目的蛋白分子质量大小分别选择 7.5%、10%或 cal overlap matrix，TOM），使用TOM构建基因间分层
12.5%十二烷基硫酸钠⁃聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋 聚类树，树状图的分支对应 10 个不同的基因模块，
白样品，转膜后以 5%脱脂牛奶室温封闭 2 h，一抗 树状图上的每一片叶子都对应一个基因，相似的基
4 ℃孵育过夜，二抗室温孵育 2 h，采用化学发光法 因被聚类到相同颜色的模块中（图 1C）。使用动态
检测试剂成像，采用Image J软件进行定量分析。 剪切树法识别基因模块，并将相似度较高的模块合
1.3 统计学分析 并，最终得到21个模块，绘制模块与脓毒症临床诊断
基因表达综合数据库数据集处理和分析均通 相关性热图（图1D、E）。其中，9个模块（合计332个
过 R 软件（4.1.0 版）完成。采用 GraphPad Prism 8 和 基因）与脓毒症显著相关（P < 0.01），分别为 Yellow
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SPSS 25.0进行统计分析与作图。定量数据以均数± （P=1.2e ）、Salmon（P=4e ）、Darkred（P=1.1e ）、
标准差（x ± s）表示，两组间比较采用独立样本 t 检 Orange（P=8.3e ）、Skyblue（P=1.2e ）、Black（P=
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验，多组间比较采单因素方差分析，组间两两比较 4e - 38 ）、Steelblue（P=3.3e - 17 ）、Brown（P=2.9e ）、
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采用LSD⁃t检验。P < 0.05表示差异有统计学意义。 White（P=6.3e ），其中 Brown 模块与脓毒症临床表
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型相关性最强（图1F）。
2 结 果
2.2 GSE65682数据集中脓毒症相关模块基因的富
2.1 WGCNA分析脓毒症数据集GSE65682 集分析
纳入GSE65682数据集中75例健康或非感染者 为确定 GSE65682 数据集中脓毒症相关模块包
作为对照组、727 例重症监护室内脓毒症患者作为 含的基因功能，对上述与脓毒症显著相关的 9 个模
脓毒症组，对其外周血测序数据进行 WGCNA 分 块内的332个基因进行GO富集分析，模块基因显著
析。通过 WGCNA 包的算法，根据无尺度网络分布 富集于免疫应答调节、免疫应答过程、衰老、经典的
拟合，设置相关系数R 为0.85，选取7作为最佳软阈 炎症相关信号通路激活等（如Wnt、NF⁃κB、MAPK级
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