Page 18 - 南京医科大学自然版
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第44卷第8期
               ·1046 ·                           南 京    医 科 大 学 学         报                        2024年8月


              验分组干预48 h后，弃上清。按1∶1 000稀释DCFH⁃                    PMSF 提取总蛋白，BCA 法测定蛋白浓度后进行定
              DA荧光探针，每孔加入1 mL稀释液，37 ℃避光孵育                       量、变性处理。随后进行电泳、转膜、封闭，β⁃actin
              30 min。PBS洗涤3次后，使用荧光显微镜进行观察                      （1∶20 000）、4⁃HNE（1∶1 000）、GPX4（1∶1 000）一抗
              拍照。用Image J软件进行荧光强度分析。                            孵育过夜，次日室温孵育二抗（1∶1 000）1.5 h后ECL
              1.2.5  MDA测定                                      显影。使用Image J软件进行灰度分析。
                  将细胞以1.3×10 个/孔接种至6孔板，按上述实                     1.3  统计学方法
                                 6
              验分组干预48 h。随后收集细胞，按照MDA检测试                              采用 Graph Pad Prism 9.0 软件进行数据分析及
              剂盒的说明，使用酶标仪测定每孔532 nm处的吸光                         作图。符合正态分布的计量资料以均数±标准差
              度，根据标准曲线计算MDA水平。                                 （x ± s） 表示，进行方差齐性检验，显示方差齐，两组

              1.2.6  GSH测定                                      间比较采用独立样本 t 检验，多组间比较采用单因
                  按说明书配制所需试剂，收集细胞上清，去除                          素方差分析，两两比较采用 Tukey’s 检验，P < 0.05
              内源性GSH；混匀反应试剂，室温反应5 min，再加入                       为差异有统计学意义。
              50 μL 0.5 mg/mL NADPH 溶液，室温反应 25 min，用
                                                                2 结     果
              酶标仪测定每孔 412 nm 处的吸光度。单点法绘制
              标准曲线并计算出GSH含量。                                    2.1  Ator抑制MIN6细胞增殖
                             2+
              1.2.7  细胞内Fe 检测                                        预实验结果显示 Ator 以时间和剂量依赖性方
                  将细胞以1.3×10 个/孔接种至6孔板，按上述实                     式抑制MIN6细胞的增殖。当Ator浓度为25 μmol/L，
                                 6
              验分组干预 48 h。去除培养液用 PBS 洗涤后，每孔                      作用48 h时，细胞存活率为（68.30±0.53）%（P < 0.01，
              加入1 μmol/L的FerroOrange工作液1 mL，37 ℃避光              图 1）。与 Ator 组相比，Ator+Z⁃VAD⁃FMK 组细胞存
              孵育30 min，使用荧光显微镜获得荧光图像。用Image                     活率（78.89±1.09）%和 Ator+Fer⁃1 组细胞存活率
              J软件进行荧光强度分析。                                     （82.06±1.87）%显著提高（P < 0.01，图1）。
              1.2.8  实时荧光定量 PCR 法检测目的基因 mRNA
                                                                                   1.5
              的表达水平                                                                            **
                  应 用 TRIzol 试 剂 盒 提 取 MIN6 细 胞 中 的 总                              1.0   ***
              RNA，采用 HIScript Ⅲ All⁃in⁃one RT SuperMix 试剂                         Relative cell viability  **
              盒将RNA逆转录为cDNA。通过荧光定量PCR系统                                            0.5
              和 SYBR Green 试剂盒进行 qRT⁃PCR。反应条件：
              95 ℃预变性5 min，95 ℃ 10 s，退火延伸 60 ℃ 30 s，
                                                                                    0
                                                    - ΔΔCT 法计
              40个循环。β⁃actin 作为内参基因，通过 2                              Ator（25 μmol/L）    -   +  +   +   +
                                                                     Fer⁃1（5 μmol/L）    -   -  +   -   -
              算基因的相对表达量。相关引物序列如下：β⁃actin                             Z⁃VAD⁃FMK（10 μmol/L）  -  -  -  +  -
             （Mouse）上游5′⁃GGCTGTATTCCCCTCCATCG⁃3′，下                   Nec⁃1（10 μmol/L）   -   -  -   -   +
                                                                              ** P < 0.01， P < 0.001（n=3）.
                                                                                     ***
              游 5′⁃CCAGTTGGTAACAATGCCATGT⁃3′；caspase⁃3
             （Mouse）上游 5′⁃TGACTGGAAAGCCGAAACTC⁃3′，                      图1 Ator对MIN6细胞存活率的影响
                                                                 Figure 1  Effects of Ator on the cell viability of MIN6 cells
              下 游 5′ ⁃ AGCCTCCACCGGTATCTTCT ⁃ 3′ ；Ripk3
             （Mouse）上游 5′⁃CAGTGGGACTTCGTGTCCG⁃3′，下              2.2  透射电镜下MIN6细胞超微结构
              游 5′ ⁃ CAAGCTGTGTAGGTAGCACATC ⁃ 3′ ；Ptgs2              电镜观察结果如图2所示，对照组MIN6细胞线
             （Mouse）上游5′⁃GGGAGTCTGGAACATTGTGAA⁃3′，              粒体结构基本正常，未见明显线粒体皱缩和嵴断

              下游 5′⁃GTGCACATTGTAAGTAGGTGGA⁃3′；Acsl4             裂，而 Ator 组 MIN6 细胞中出现染色质浓缩的凋亡
             （Mouse）上游 5′⁃CTCACCATTATATTGCTGCCTGT⁃              特征，线粒体肿胀、空化，数量减少，线粒体嵴断裂
              3′ ，下 游 5′ ⁃ TCTCTTTGCCATAGCGTTTTTCT ⁃ 3′ ；       或减少，双层膜密度增加的铁死亡特征（红色箭

              Gpx4（Mouse）上 游 5′ ⁃ GCCTGGATAAGTACAGGG ⁃          头）。细胞膜破裂，可见大量溶酶体，有自噬小体形
              GTT⁃3′,下游5′⁃CATGCAGATCGACTAGCTGAG⁃3′。             成（黑色箭头）。
                                                                                       2+
              1.2.9  Western blot检测蛋白的相对表达量                     2.3 Ator对MIN6细胞Fe 及脂质过氧化的影响
                  各组干预结束后收集细胞，使用蛋白裂解液和                               如图 3 所示，与对照组相比，Ator 组细胞内 Fe             2+
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