Page 32 - 南京医科大学学报自然科学版
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第44卷第1期
               · 26  ·                           南 京    医 科 大 学 学         报                        2024年1月


              市第二人民医院提供。所有标准菌株保存于-80 ℃                          100 μL Tris⁃EDTA 中，100 ℃加热煮沸 10 min，释放
              超低温冰箱，使用前于35 ℃微生物培养箱活化。为                          基因组DNA。
              验证RPA⁃LFS技术对临床标本的适用性，于2022年                       1.2.2  引物设计及RPA反应
              1—12 月收集 108 例临床检验样本，其中 57 例来自                         在美国国家生物技术信息中心网站（https://
              痰液，30例来自尿液，21例来自血液。                               www.ncbi.nlm.nih.gov）检 索 SMA 特 异 性 序 列 NC_
                                                                010943.1。使用 Primer premier 5 软件设计引物对，
                           表1 本研究所用标准菌株                         由通用生物有限公司（中国）合成。引物设计原则
                    Table 1  Standard strains used in this study
                                                                如下：引物长度 30~35 bp；GC 含量 30%~70%；扩增
                          Strains             ID Number
                                                                子长度 100~500 bp；最大单核苷酸重复长度为 5。
                   SMA                       ATCC 17666
                                                                使用基础型 RPA 试剂盒筛选最佳引物对。RPA 反
                   Staphylococcus haemolyticus  ATCC 29970
                   Staphylococcus epidermidis  ATCC 12228       应体系共 50 μL，向含有酶组分的反应管中加入
                   Staphylococcus aureus     ATCC 43300         29.4 μL 反应缓冲液、2.4 μL 10 μmol/L 上游引物
                   Escherichia coli          ATCC 8739          （F）、2.4 μL 10 μmol/L下游引物（R）、13.3 μL基因组
                   Enterococcus faecalis     ATCC 29212         模板和2.5 μL 280 nmol/L醋酸镁溶液。上下颠倒充
                   Enterococcus faecalis     ATCC 700221        分混匀反应管内溶液，瞬时离心。将反应管置于
                   Acinetobacter baumannii   ATCC 19606
                                                                37 ℃水浴锅孵育30 min。RPA 反应完成后，使用等
                   Haemophilus influenzae    ATCC 49247
                                                                体积的苯酚⁃氯仿⁃异戊醇（25∶24∶1）混合液抽提
                   Pseudomonas aeruginosa    ATCC 15692
                                                                RPA扩增产物。12 000 r/min离心5 min，取上清，加
                   Klebsiella Pneumoniae     ATCC 00603
                                                                入适量 DNA 上样缓冲液，通过 2%琼脂糖凝胶电泳
                   Candida albicans          ATCC 10231
                   Vibrio Parahaemolyticus   ATCC 17802         分离（90 V，30 min），在紫外灯下观察RPA反应产物。
                                                                1.2.3  探针设计及RPA⁃LFS反应
              1.1.2  主要仪器和试剂                                         根据 RPA 反应筛选出最佳引物对后，将上游
                  微生物培养箱（上海 BluePard 公司），震荡培养                   引物向3′端方向延长16 bp即为探针序列。探针的
              箱（上海旻泉公司），超微量分光光度计（Quawell 公                      5′端使用 FITC 标记，3′端使用 C3⁃间臂基团（3′⁃
              司，美国），电热恒温水浴锅（上海精宏公司），电泳                          Block）修饰，探针中部的一个碱基使用四氢呋喃
              仪（Bio⁃Rad 公司，美国），全自动凝胶成像分析系统                      （tetrahydrofuran，THF）取代，其中至少 30 bp 位于
             （上海培清公司），细菌基因组提取试剂盒（北京天                            THF位点的5′端，至少15 bp位于其3′端。下游引物
              根公司），基础型RPA试剂盒、nfo型RPA试剂盒、侧                       的 5′端使用生物素（Biotin）标记。RPA⁃LFS 反应体
              向流动试纸条（常州安普未来公司）。                                 系共 50 μL，向含有酶组分的反应管中加入 29.4 μL
              1.2  方法                                           反应液、2.1 μL 10 μmol/L上游引物、2.1 μL 10 μmol/L
              1.2.1  微生物基因组提取                                   下游引物、0.6 μL 10 μmol/L探针、13.3 μL基因组模
                  将冻存的SMA接种于哥伦比亚血琼脂平板，置                         板溶液和2.5 μL 280 μmol/L醋酸镁溶液。上下颠倒
              于 35 ℃微生物培养箱培养 24 h。挑取培养皿上的                       充分混匀反应管内溶液，瞬时离心。将反应管置于
              单菌落，置于 5 mL Luria⁃Bertani 培养基中，在 35 ℃             37 ℃水浴锅孵育 12 min。使用双蒸水将反应产物
              振荡培养箱中震荡培养12 h。根据细菌基因组提取                          稀释20倍，取50 μL稀释液滴加入试纸条的加样孔

              试剂盒说明书提取 SMA 基因组 DNA，保存于-20 ℃                     中，等待显色。
              备用。基因组 DNA 浓度使用超微量分光光度计定                          1.2.4  特异度检验
              量。其他标准菌株和临床分离的 SMA 使用加热煮                               为检测RPA⁃LFS体系的特异度，使用该方法检

              沸法提取DNA。菌株培养后，挑取菌苔置于100 μL                        测了其他12种临床常见标准菌株和12株临床来源
              Tris⁃EDTA 中，100 ℃加热煮沸 10 min，释放基因                 的SMA，检测方法如前文所述。
              组 DNA。基因组提取液冷却后，12 000 r/min 离心                   1.2.5  灵敏度检验
              5 min，取上清转移至无菌 EP 管，保存于-20 ℃备                          使用双蒸水梯度稀释SMA基因组DNA（1×10 、
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              用。用于RPA⁃LFS检测的临床样本，使用加热煮沸                         1×10 、1×10 、1×10 、1×10 、1×10 、10 CFU/mL）用于检
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              法粗提基因组。12 000 r/min 离心 5 min，沉淀溶于                 测RPA⁃LFS 体系的灵敏度。取1 μL基因组DNA稀
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