Page 34 - 南京医科大学学报自然科学版

第44卷第1期
· 28 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2024年1月

（图 3B）。在反应温度为 22 ℃时，检测线无条带， 时，无目的产物的扩增。与假设相符，当反应温度
27 ℃时检测线出现较浅的条带。反应温度在37 ℃~ 达到52 ℃时，检测线无条带。综合时间、经济成本，
42 ℃，具有较为清晰的阳性条带。考虑到RPA⁃LFS RPA⁃LFS 法的最佳反应条件为 37 ℃，反应 8 min。
反应体系所需的酶不耐高温，推测反应温度为52 ℃ 后续实验将采用该条件进行。

A B F1/R1/P1 F/R/P
Marker Set 1 NTC 1 Set 2 NTC 2 Set 3 NTC 3 Set 4 NTC 4 F1/R1/P1 NTC F/R/P NTC

5 000 bp
3 000 bp
2 000 bp
Control line
1 000 bp Test line
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp

C
GGCAAG ［THF］ GGCAGG ［THF］
CGCTTC CCGGTC
ACGGC ［THF］ ACGGC ［THF］
TGCCG TACCG
TGAACG ［THF］ TGAGCG ［THF］
GTTGC GTTGC
TGAACGAAG ［THF］ TGAACGGAG ［THF］
TGAAC
TGAAC
CTTC CTTC
TGAAC ［THF］ TGAGC ［THF］
CTTCTTG CTTCTTG
FITC 3’Block Biotin
A：The RPA results was visualized by agarose gel. B：RPA⁃LFS results before and after base mismatch. C：Schematic diagram of base mismatch sites.
图2 最佳引物对筛选及探针设计
Figure 2 Optimal primers for screening and probe design

表3 RPA⁃LFS探针序列
Table 3 RPA⁃LFS probe sequences

Name Sequences（5′→3′） Length（bp）
F1 TGAACGAAGGCAAGATCCACGGCTACATCTG 31
R1 Biotin⁃CTTGCCGTTGTATTCCATCGCCAGTTCTTC 30
P1 FITC⁃TGAACGAAGGCAAGATCCACGGCTACATCT［THF］ 47
CAGGGCTTCAATCCGC⁃/C3⁃spacer/
F TGAGCGGAGGCAGGATCCACGGCTACATCTG 31
R Biotin⁃CTGGCCATTCTATTCCATCGCCAGTTCTTC 30
P FITC⁃TGAGCGGAGGCAGGATCCACGGCTACATCTG［THF］ 47
CAGGGCTTCAATCCGC⁃/C3⁃spacer/
F：Forward primer. R：Reverse primer. P：Probe. The underline represents the base mutation site. The red font represents a modification.

A B
0 min 2 min 4 min 6 min 8 min 10 min 12 min 22 ℃ 27 ℃ 32 ℃ 37℃ 42 ℃ 47 ℃ 52 ℃

A：Optimization of the reaction time for RPA⁃LFS. B：Optimization of the reaction temperature for RPA⁃LFS.
图3 RPA⁃LFS反应时间和温度的优化
Figure 3 Optimization of RPA⁃LFS reaction conditions