Page 35 - 南京医科大学学报自然科学版

第44卷第1期 季 拓，高玉芝，王 彦，等. 重组酶聚合酶扩增结合侧向流动试纸条技术快速可视化检测嗜麦芽
2024年1月 窄食单胞菌方法的建立与应用［J］. 南京医科大学学报（自然科学版），2024，44（01）：024-031 · 29 ·

2.3 RPA⁃LFS检测的特异度分析 未出现阳性信号，当使用临床分离的 SMA 基因组
为评价 RPA⁃LFS 检测法是否能特异性检测 DNA 作为模板时，检测线上出现了明显的阳性信
SMA，使用 12 种临床常见致病菌和 12 株 SMA 临床 号（图 4B）。结果表明，建立的 RPA⁃LFS 检测体系
分离株进行 RPA⁃LFS 检测。如图 4A 所示，使用其 对 SMA 具有良好的特异度，与其他病原菌无交叉
他致病菌基因组作为RPA⁃LFS反应模板时，检测线 反应。

A B
ATCC ATCC ATCC ATCC ATCC ATCC
1 2 3 4 5 6
29970 12228 43300 8739 29212 700221

ATCC ATCC ATCC ATCC ATCC ATCC
7 8 9 10 11 12
19606 49247 15692 00603 10231 17802

A：RPA⁃LFS method for detecting 12 common pathogens. B：RPA⁃LFS method was used to detect 12 clinical sources of SMA.
图4 RPA⁃LFS特异度检测
Figure 4 Specificity of the RPA⁃LFS assay

2.4 RPA⁃LFS检测的灵敏度分析 对收集的 108 例临床标本进行检测，结果显示，
为评估 RPA⁃LFS 方法的最低检测限，以梯度 RPA⁃LFS 法和qPCR 法检测108例标本中有23例样
稀释的 SMA 基因组 DNA 为反应模板。反应体系 本呈现SMA阳性，而采用生化培养法只检测出22例
中含有 1×10 CFU 基因组时，检测线上出现强的阳 样本为阳性。建立的RPA⁃LFS方法与qPCR法的符
4
性信号，随着模板浓度的降低，阳性条带的颜色减 合率为100%。RPA⁃LFS与传统生化培养方法的阳性
弱。当浓度低至1×10 CFU时，阳性信号完全消失 符合率为 99.07%，kappa 指数值为 0.972，P < 0.001，
-1
（图5A）。此外，为了进一步确定RPA⁃LFS检测的准 说明RPA⁃LFS与传统生化培养方法一致性较好。
确LOD，对所有浓度进行10次独立的检测。结果显 表4 RPA⁃LFS与qPCR法和传统生化培养法比较
示，当反应体系中基因组含量为1 CFU时，有9次为 Table 4 Comparison of RPA⁃LFS，qPCR，and traditional
阳性结果，基因组含量为1×10 CFU时，有1次结果 bacterial culture methed
-1
呈阳性。通过 SPSS 软件对 10 次检测的结果进行 Positive Negative Total
Methods Test time
probit 回归分析（图 5B）。在 95%的阳性概率下， samples samples samples
RPA⁃LFS 反应的最低检测限为 1.107 CFU。为了测 RPA⁃LFS 23 85 108 < 20 min
试该系统是否能抵抗其他物种基因组的干扰，除了 qPCR 23 85 108 About 90 min
Bacterial culture 22 86 108 About 2 d
在反应体系中加入 SMA 基因组外，额外加入 10 ng
的人类基因组DNA。结果显示，该方法检测灵敏度
3 讨 论
不受人类DNA的影响（图5C）。
2.5 RPA⁃LFS在临床标本检测中的应用 病原微生物的即时、精确诊断是临床检验不可
通过与 qPCR 法 ［16］ 和传统生化培养法比较，评 忽视的难点之一。本研究开发了一种改良型的
估 RPA⁃LFS 方法在临床中的实际应用价值（表 4）。 RPA⁃LFS 方法，用于检测 SMA，既实现了 SMA 的快