Page 36 - 南京医科大学学报自然科学版

第44卷第1期
· 30 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2024年1月

A B
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1×10 CFU 1×10 CFU 1×10 CFU 1×10 CFU 1×10 CFU1×10 CFU1×10 CFU
Probit regression
120
（ % ） 100
80
Positive reaction 60
40
C 20
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1×10 CFU 1×10 CFU 1×10 CFU 1×10 CFU 1×10 CFU1×10 CFU1×10 CFU 1×10 1×10 -1 1 10 1×10 1×10 1×10 4
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Template amounts（CFU/reaction）
A：The sensitivity of RPA⁃LFS system was measured using different concentrations of SMA genomes. B：The LOD of the RPA⁃LFS was estimated
with a probit regression model by SPSS，the horizontal dashed line represents 95% detection limit. C：Human genomic DNA was added in the RPA⁃LFS
system to determine anti⁃interference capacity of the RPA⁃LFS assay.
图5 RPA⁃LFS检测的灵敏度分析
Figure 5 The sensitivity of the RPA⁃LFS assay

速检测，也拓宽了RPA⁃LFS的应用范围。 到检测的特异性，这种错配不可避免。通过优化反
SMA 常与金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、鲍 应时间和温度，确定了RPA⁃LFS体系的最佳反应条
曼不动杆菌等混合生长 ，传统的微生物分离培养 件为37 ℃，扩增时间为8 min。根据probit回归分析，
［1］
技术对于鉴定 SMA 具有一定挑战性。PCR 技术快 确定该体系检测 SMA 的最低检出限为 1.107 CFU，
速准确、灵敏度高，但该方法需要复杂的反应仪器 且灵敏度不受其他物种基因组干预。通过对108例
且用时较长，不适用于病原微生物的快速检测 ［17］ 。 临床来源的微生物样本进行检测以验证临床适用
相比其他分子扩增技术，RPA可在较低的温度中进 性，我们建立的 RPA⁃LFS 方法与 qPCR 检测结果相
行，不依赖于仪器的精准温控，有利于 POCT 的发 符，具有一致性。但由于反应时间的缩短、检测设
展 ［8］ 。将 RPA 技术与 LFS 检测方法联合使用，可 备的简易，以及碱基错配位点的引入，RPA⁃LFS 体
在短时间内实现对靶基因的快速可视化检测。在 系的灵敏度略低于 qPCR 检测法 ［16］ 。与传统的“金
RPA⁃LFS 反应过程中，DNA 聚合酶从上游引物的 标准”生化培养法相比，RPA⁃LFS 较为灵敏且不需
3′端开始移位以产生较小的扩增子，从断裂探针 要经过纯化步骤，大大缩短检测时间，两种检测方
的 3′端开始移位产生双标记扩增子（主要扩增子）， 法的阳性符合率为99.07%，kappa指数值为0.971 8，
用于下游试纸条的“三明治”检测 。 对比差异无统计学意义，说明两种方法具有良好的
［18］
本研究根据 SMA 特异性序列（NC_010943.1） 一致性。22例均被定义为SMA阳性的样本，其患者
设计引物和探针。该基因序列由 Fraser 等 ［16］ 于 临床诊断为SMA感染，经抗菌药物治疗后康复。其

2019 年首次鉴定为 SMA 的保守序列，可用于 SMA 中不一致的1例样本被全自动微生物鉴定仪定义为
的鉴定。在设计探针过程中，发现下游引物和探针 鲍曼不动杆菌，来源于痰液，其误差原因可能为技
产生的引物二聚体会导致假阳性信号的发生，因此 术人员在分离纯化时操作失误。由于非无菌部位
本研究引入碱基错配以避免假阳性信号。文献报 标本常常有多种细菌生长，即使看似较纯的菌落，
道，RPA 反应可允许少许错配碱基的引入 ［19］ ，但要 下面也有可能掩盖不易觉察的小菌落。该患者在
避免在 3′端引入错配。在引入错配碱基后，本研 治疗过程中，重新采取痰液并分离纯化，经全自动
究建立了适用于特异性检验SMA的引物⁃探针序列 微生物鉴定仪检测，确诊感染 SMA。因此，实验人
F/R/P。值得注意的是，扩增效率及扩增产物检测效 员不能过分依赖仪器，动手操作时也要刻画入微，
能在理论上逊色于错配前的引物探针组合，但考虑 避免误差。