Page 33 - 南京医科大学学报自然科学版

第44卷第1期 季 拓，高玉芝，王 彦，等. 重组酶聚合酶扩增结合侧向流动试纸条技术快速可视化检测嗜麦芽
2024年1月 窄食单胞菌方法的建立与应用［J］. 南京医科大学学报（自然科学版），2024，44（01）：024-031 · 27 ·

释液加入 RPA⁃LFS 反应管中，补双蒸水至 13.3 μL， 样本个数+共同阴性样本个数）÷样品总数×100%，
使得每个反应分别含有 1×10 、1×10 、1×10 、10、1、 计算 RPA⁃LFS 法与另外两种方法的符合率，通过
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1×10 、1×10 CFU SMA的基因组，其余步骤如前文 kappa指数来评估该方法与其他方法的一致性。
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所述。每组浓度进行 10 次独立实验，通过对 10 个 1.3 统计学方法
独立实验的概率回归分析，确定该方法的最低检测 实验结果用 SPSS 13.0 软件分析。对临床检测
限（limit of detection，LOD），即 95%的概率检测出阳 数据进行 kappa 一致性检验，kappa 值 > 0.8 表示一
性产物的最低浓度。 致性较强，P < 0.05表明kappa值可靠。
1.2.6 临床标本检测
2 结 果
通过与生化培养法和qPCR检测法进行比较来
评估 RPA⁃LFS 法在临床标本检测中的实际应用价 2.1 引物和探针设计
值。用于生化培养法和qPCR检测法检测的临床样 根据 SMA 特异性基因序列 NC_010943.1 设计
本使用选择培养基进行培养，置于35 ℃微生物培养 出4组引物对（表2），对4组候选引物对进行基础型
箱培养 18~48 h。VITEK 2 全自动微生物分析系统 RPA反应（图2A）。4组引物对均产生了与预期大小
进行菌种鉴定。根据基因序列 NC_010943.1 设计 一致的靶向条带，分别为470、163、369、189 bp，但在
qPCR 引物 ［16］ ，按照操作流程对临床样本使用 qPCR 无模板对照（no template control，NTC）中出现了少量

法进行检测。qPCR 法步骤如下：95 ℃预变性 2 min 小于100 bp的引物二聚体条带。相比之下，引物对
后进入循环阶段，95 ℃变性 10 s，56 ℃退火 50 s， 1 具有较亮的目标条带，并且无肉眼可见的引物二
72 ℃延伸15 s，共40个循环。根据公式：（共同阳性 聚体。因此，选择引物对1用于探针的设计。

表2 RPA引物对序列
Table 2 RPA primer sequences
Primer pair Name Primer sequence（5′→3′） Primer length（bp） Product length（bp）
Set 1 SMA⁃F1 TGAACGAAGGCAAGATCCACGGCTACATCTG 31 470
SMA⁃R1 CTTGCCGTTGTATTCCATCGCCAGTTCTTC 30
Set 2 SMA⁃F2 CTACCCGAAGTTCCACGTCAGCCTGATGAA 30 163
SMA⁃R2 GCAGATGTAGCCGTGGATCTTGCCTTCGTT 30
Set 3 SMA⁃F3 CACTTCTGGACCAAGCACGGCAAGTTGAAC 30 369
SMA⁃R3 GATTGCAGTGACATGGCGTGTCTCCTACAC 30
Set 4 SMA⁃F4 GAGCGAACAGTCGTGGACGGTGATGAAGTT 30 189
SMA⁃R4 ATGCAGTTCTCTTCCTGGAAGTCGACGATG 30
F：Forward primer. R：Reverse primer.

根据引物对 1 的上游引物设计探针，修饰后的 的 3 个碱基不能替换；每条引物上替换的碱基不超
探针和引物见表 3，通过 RPA⁃LFS 检测引物探针组 过 5 个；不能有连续的 2 个碱基替换；优先使用 A⁃G
合 F1/R1/P1 的扩增性能及时确定是否存在假阳性 互换、T⁃C 互换。F1/R1/P1 引物⁃探针组合可产生
的情况。结果如图 2B 所示，F1/R1/P1 引物⁃探针组 的引物二聚体和碱基错配如图 2C 所示。当引入
合提供了正确的阳性信号（检测线和质控线上都 适当碱基错配后，无模板对照组的假阳性信号消失
有可见的红色条带），这表明 F1/R1/P1 引物⁃探针 （图 2B），后续实验使用F/R/P引物⁃探针组合。
组合具有良好的扩增性能。然而，在无模板对照组 2.2 RPA⁃LFS反应条件的优化
中，检测线上也显示出一条可见的弱化红带，表明 为实现RPA反应条件的最优化，对其反应时间
F1/R1/P1 引物探针组合存在假阳性扩增。考虑到 和温度进行了改良。控制反应温度为37 ℃，将反应
RPA反应环境下可能发生不利的引物相互作用，产 时间分别设置为0、2、4、6、8、10、12 min（图3A）。结
生较低分子量的DNA副产物（< 100 bp），即“引物噪 果显示，反应4 min时检测线出现颜色较弱的条带，
音”。为减少“引物噪音”的产生，本研究在引物中 在 8 min 时检测线条带清晰明亮。8 min 后，随着反
适当引入了碱基错配。错配原则如下：对具有 4 个 应时间的延长，检测线无明显变化。控制反应时
以上连续配对碱基的区域进行碱基错配；靠近3′端 间，分别在22、27、32、37、42、47、52 ℃进行RPA扩增