Page 10 - 南京医科大学自然版

第45卷第1期
· 4 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2025年1月

组、Sham+MON组和CLP+DEX组。通过腹腔注射氯 行盲肠结扎和穿刺。CLP 术后连续5 d，每日1次腹
胺酮（100 mg/kg）麻醉小鼠，在腹部中线切口以暴露 腔注射药物或生理盐水。Sham+MON 组和 CLP+
盲肠，在回盲瓣远端分离并用 3 号丝线结扎盲肠。 MON 组小鼠腹膜内注射MON（20 mg/kg），CLP+DEX
用 21 号针穿刺两次，挤出少许粪便，然后放回腹腔 组给予DEX（2 mg/kg），其余各组注射等量生理盐水。
并缝合腹膜。皮下注射 0.1 mL 无菌生理盐水进行 每天监测各组小鼠存活率，第5天采集血液、安乐死全
液体复苏 ［12］ 。Sham组仅切开腹部并缝合切口，不进 部小鼠后，采集肾脏皮质用于后续实验（图1B）。

A B Blood and
tissue collection
HO O
Negative control
H Sham
surgery
Sham
O CLP
HO CLP
H
HO
O O CLP
HO CLP+MON
CLP
HO OH CLP+DEX
Sham
OH surgery
Sham+MON
0 d 1 d 2 d 3 d 4 d 5 d

0.9% Saline Monotropein Dexamethasone
A：Chemical structure formula of Monotropein. B：Experimental procedure.
图1 MON化学结构式和实验设计流程图
Figure 1 Chemical structure formula of MON and experimental design flow chart

1.2.2 苏木精⁃伊红（hematoxylin⁃eosin，HE）染色 酶活性或产品含量。
肾组织用4%多聚甲醛固定24 h，石蜡包埋后制 1.2.5 ROS检测
备4 μm厚的切片，用HE 染色切片。使用光学显微 肾脏组织速冻后切片，分别使用5 μmol/L DHE
镜观察图像并进行病理学评分。由病理学家按照 和DAPI对肾组织进行ROS和细胞核染色。通过共
炎症细胞浸润程度进行评分。没有炎症细胞浸润 聚焦显微镜进行成像，随机选取10个视野计算平均
计为 0 分，轻度炎症细胞浸润（40 倍镜视野下可见 荧光强度。
1~10 个炎症细胞）计为 1 分，中度炎症细胞浸润 1.2.6 RT⁃qPCR
（11~50 个炎症细胞）计为 2 分，重度炎症细胞浸润 使用TRIzol试剂从小鼠肾组织中提取总RNA，用
（>50个炎症细胞）计为3分。 MonScript RTⅢ Super Mix 将其逆转录为 cDNA。用
1.2.3 生化指标检测 SYBR Green qPCR Mix 配制 RT⁃qPCR 反应体系，按
血液样本4 ℃静置过夜，第2天将样本在8 000 g 照制造商的说明在实时荧光定量 PCR 仪上设定反

4 ℃离心 10 min。按照生产商提供的说明，使用 VI⁃ 应程序并进行 PCR 检测。以β⁃actin 为内参基因，
-ΔΔCT 法计算各靶基因的mRNA表达水平。
TROS Chemistry Products BUN Slides 和 VITROS 采用 2
Chemistry Products CRE Slides 商 用 试 剂 盒 ，在 1.2.7 ELISA
VITROS 4600 全自动生化分析仪上检测 BUN 和 收集血清和细胞培养上清液，按照 ELISA 试剂
CRE 含量。 盒说明，检测TNF⁃α、IL⁃1β和IL⁃6的水平。首先，将
1.2.4 氧化应激指标检测 梯度稀释的标准品和待测样本加入酶标板，37 ℃孵
制备肾组织匀浆液，使用 GSH、CAT、T⁃AOC 和 育0.5 h。接着，添加酶标试剂并在 37 ℃避光条件

MDA试剂盒分别在412 nm、405 nm、520 nm和532 nm 下孵育 0.5 h。加入 1×TMB 显色液，室温避光孵育
波长下，用多功能微孔板检测器测定吸光度，计算 10 min后，用2 mol/L H2SO4终止反应，使用酶标仪在