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第45卷第1期 王 巧，强静超，卞 乐，等. 水晶兰苷通过调节NF⁃κB/NLRP3 炎症小体通路改善脓毒症相关
2025年1月 急性肾损伤和功能障碍［J］. 南京医科大学学报（自然科学版），2025，45（1）：1-12 · 5 ·

450 nm处测定样品吸光度。最后，绘制标准曲线并 用 BCA 试剂盒测定蛋白浓度。将等量蛋白样本通
计算待测样品中细胞因子的含量。 过 12% SDS⁃PAGE 进行蛋白分离，然后将蛋白转移
1.2.8 HK⁃2细胞培养和处理 到 PVDF 膜上，用 5%脱脂奶粉室温封闭膜 1 h。将
HK⁃2 细胞在含 10%胎牛血清和 1%抗生素 PVDF膜与稀释好的一抗在4 ℃孵育过夜，第2天将
（100 U/mL 青霉素和 100 μg/mL 链霉素）的 DMEM/ 膜与 HRP 标记的二抗孵育室温 1 h。TBST 清洗膜
F12 培养基中培养。首先用 MON（32 μmol/L）预刺 3 次，每次10 min。最后，使用ECL化学发光液对蛋
激细胞 2 h，然后用 LPS（1 μg/mL）继续刺激 6 h 和 白进行曝光显影。使用 Image J 软件分析蛋白条带
ATP（5 mmol/L）刺激 0.5 h，以建立 MON 干预的脓毒 的灰度值。β⁃actin作为内参，用于定量每种蛋白的
症诱导的肾损伤细胞模型。 相对表达水平。
1.2.9 CCK⁃8检测 1.3 统计学方法

5
将 HK⁃2 细胞以 1×10 个/孔的浓度接种在 96 采用 GraphPad Prism 9.5.1 软件对实验数据进
孔板中。用不同浓度梯度的 MON（0、4、8、16、32、 行统计学分析，数据用均数±标准差（x ± s）表示。两
64、128、256 μmol/L）处理细胞 12 h。然后每孔加 组之间的比较采用 t 检验，多组比较采用单因素方
入 10 μL 的 CCK⁃8 试剂，置于 37 ℃培养箱中继续 差分析，随后用Tukey检验进行组间差异比较。P <
孵育 2 h。最后，用酶标仪测定 450 nm 波长处的 0.05为差异有统计学意义。
吸光度。
2 结 果
1.2.10 细胞转染
TM
根据Lipo6000 转染试剂说明书，将含有pCMV⁃ 2.1 MON改善S⁃AKI小鼠存活率和肾脏外观
Myc ⁃ Ikbkb（human）和 pCMV ⁃ NLRP3（human）⁃ 3 × 生存曲线结果显示，CLP 组小鼠的死亡率较
FLAG⁃Neo 质粒 DNA 的培养基加入 Lipo6000 溶液 Sham组明显上升（P < 0.001），表明成功建立了CLP
TM
中制备质粒 DNA⁃脂质体复合物，然后将 DNA⁃脂质 诱导的小鼠模型；与 CLP 组相比，CLP+MON 组和
体复合物加入含有HK⁃2细胞的培养基中混匀。将 CLP + DEX 组 小 鼠 的 死 亡 率 下 降（P < 0.01、P <
细胞置于37 ℃、5%CO2的培养箱中培养，6 h后更换 0.001），CLP+MON 组与 CLP+DEX 组小鼠存活率接
为含 2%胎牛血清的 DMEM/F12 培养基，继续培养 近，差异无统计学意义（图2A），证实MON可以提高
48 h后，用于后续实验。 CLP小鼠的存活率。进一步采集各组小鼠的新鲜肾
1.2.11 Western blot检测 脏并观察其外观，如图2B所示，与NC组和Sham组相
使用 RIPA 裂解液制备肾组织蛋白样本，随后 比，CLP组肾脏外观颜色明显发黑。与CLP组相比，

A B NC Sham CLP
NC
Sham
CLP
CLP+MON
Sham+MON
CLP+DEX
100
（%） 80 ***
Percent survival 60 CLP+MON Sham+MON CLP+DEX
**
40
20
0
0 1 2 3 4 5
Time（d）

**
A：The survival curve of mice in each group. B：Pictures of fresh kidneys of mice in each group. P < 0.01 and *** P < 0.001（n=15）.
图2 MON对S⁃AKI小鼠存活率及肾脏外观的影响
Figure 2 Effects of MON on the survival rate and kidney appearance in the S⁃AKI mice