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第45卷第10期 王景泽，李倩倩，弓玄伟，等. 脑痰清在AD小鼠神经干细胞增殖中的作用和机制［J］.
2025年10月 南京医科大学学报（自然科学版），2025，45（10）：1386-1394，1486 ·1389 ·

解10~15 min，加入100 μL三氯甲烷，震荡混匀后冰上 液染色后使用激光共聚焦显微镜拍照（546 nm）并
静置5 min，12 000 r/min 4 ℃离心15 min。吸取水相 统计。
层移至1.5 mL离心管，加入等体积（约200 μL）异丙 1.2.9 细胞活力检测
醇，震荡混匀后置于-20 ℃沉淀20 min，12 000 r/min 按照 CCK⁃8 试剂盒说明书，用 PBS 及不同浓度
4 ℃离心15 min后弃上清。加入500 μL 70%乙醇洗 的 NTQ 处理 NSC，其后加入 CCK⁃8 溶液，37 ℃避光
涤沉淀，12 000 r/min 4 ℃离心 5 min，弃上清后室温 孵育2 h后，使用酶标仪检测450 nm处的吸光度值。
晾干 3~4 min，加入 20 μL 无 RNase 水溶解，测定浓 1.3 统计学方法
度后反转录合成 cDNA，根据实时荧光定量 PCR 说 利用 GraphPad Prism 8 进行数据分析，数据用
明书进行检测，引物序列见表1。 均值±标准差（x ± s）表示，两组比较通过 t 检验（双

尾）进行统计，多组比较使用单因素方差分析，P <
表1 RT⁃qPCR引物序列
0.05为差异有统计学意义。
Table 1 RT⁃qPCR primers
Gene Sequence（5′→3′） 2 结 果
SOX2⁃F GCGGAGTGGAAACTTTTGTCC
SOX2⁃R CGGGAAGCGTGTACTTATCCTT 2.1 NTQ维持AD小鼠中NSC数量
DCX⁃F CATTTTGACGAACGAGACAAAGC 2.5 月龄 5×FAD 小鼠用 NTQ 喂养 4 个月后，取
DCX⁃R TGGAAGTCCATTCATCCGTGA 小鼠海马组织进行免疫荧光染色、Western blot 和
GATA2⁃F CACCCCGCCGTATTGAATG RT⁃qPCR 检测（图 1A）。结果显示，与 AD 组相比，
GATA2⁃R CCTGCGAGTCGAGATGGTTG AD+NTQ 组小鼠大脑的海马齿状回区上颗粒层
p27/Kip1⁃F TCAAACGTGAGAGTGTCTAACG
SOX2 阳性细胞数量显著增加（图 1B、C）；同时，
p27/Kip1⁃R CCGGGCCGAAGAGATTTCTG
SOX2 的mRNA和蛋白水平明显增加（图1D~F）。
cyclin A1⁃F TGATGCTTGTCAAATGCTCAGC
2.2 NTQ促进NSC的增殖
cyclin A1⁃R AGGTCCTCCTGTACTGCTCAT
取E15.5小鼠，体外分离培养NSC（图2A），分别使
cyclin B2⁃F GCCAAGAGCCATGTGACTATC
cyclin B2⁃R CAGAGCTGGTACTTTGGTGTTC 用 PBS、0.062 5 μg/mL、0.625 0 μg/mL、6.250 0 μg/mL
cyclin D1⁃F CGGAGACGCATCACCTCTG 及62.500 0 μg/mL NTQ处理细胞。CCK⁃8检测结果显
cyclin D1⁃R AGGGAGTGGAGGAGTCATTCG 示，0.062 5、0.625 0 μg/mL NTQ对细胞活力无影响，而
cyclin E1⁃F AAGCCCTCTGACCATTGTGTCC 6.250 0 μg/mL和62.500 0 μg/mL处理组显示细胞毒性
cyclin E1⁃R CTAAGCAGCCAACATCCAGGAC
（图2B）。细胞凋亡检测结果显示，0.625 0 μg/mL NTQ
β⁃actin⁃F GGCTGTATTCCCCTCCATCG
处理不影响细胞存活（图 2C、D）。因此，后续选用
β⁃actin⁃R CCAGTTGGTAACAATGCCATGT
0.625 0 μg/mL NTQ处理NSC。
1.2.7 蛋白免疫印迹法 使用 PBS、NTQ 或美金刚处理体外分离培养的
组织或细胞样品中加入含 Cocktail 的裂解液， 神经球，明场统计、RT⁃qPCR、Western blot 检测等结
冰上裂解 10~15 min 后转移至 1.5 mL EP 管中。使 果显示，与PBS组相比，NTQ组神经球的直径明显增
用 BCA 法测定蛋白浓度后，加入 Loading buffer，置 大，其中，直径>70 μm的神经球数目显著增加、直径
于 99 ℃金属浴中变性 10 min 制成蛋白样品。进行 <50 μm 神经球的数目显著减少（图 3A~C）；SOX2 、
+
电泳和转膜，将 NC 膜放入脱脂牛奶溶液（5%）中封 BrdU 和 DCX 细胞数显著增加（图 3D~G）；SOX2、
+
+
闭 1 h，TBST 洗膜后一抗孵育过夜，次日 TBST 洗涤 DCX 的 mRNA 水平显著上调（图 3H）；SOX2 蛋白水
3 次后二抗溶液室温孵育 1 h，经 TBST 洗涤后加发 平增加（图 3I~J）；这些表现与阳性药物美金刚效果
光液进行显影。一抗稀释比例：SOX2（1∶2 000）、 一致。以上结果表明，NTQ可促进NSC增殖和神经

GATA2（1∶500）、p27/Kip1（1∶500）、cyclin D1 发生。
（1∶1 000）、β⁃actin（1∶2 000）。 2.3 NTQ促进NSC增殖的分子机制
1.2.8 细胞凋亡检测 对细胞周期相关基因cyclin A1、cyclin A2、cyclin
根据细胞凋亡检测试剂盒说明书，将工作液 B2 以及 cyclin D1 进行 RT⁃qPCR 检测，结果显示，与
（TdT 酶 5 μL+荧光标记液 45 μL/每个样品）滴加于 AD组相比，AD+NTQ组中cyclin D1 mRNA水平显著
固定后的细胞爬片，37 ℃避光孵育 1 h，加 DAPI 溶 增加（图 4A）。随后，对 cyclin D1 上游分子 GATA2