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第45卷第10期
·1388 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2025年10月
小 鼠（transgenic mice with five familial Alzheimer’s 粮食均可自由获取。动物实验均符合军事医学研
disase，5×FAD小鼠）和NSC体外培养体系，利用病理 究院动物管理和使用委员会规定（动物伦理编号：
学、分子生物学等技术手段，通过体外、在体实验探究 IACUC⁃DWZX⁃2022⁃561）。
NTQ在AD小鼠NSC增殖中的作用，并初步解析其分 1.2 方法
子机制。这为NTQ治疗AD提供理论依据，为中药复 1.2.1 NTQ及其用量
方在神经退行性疾病防治中的应用奠定基础。 NTQ 由胆南星 15 g、黄芩 8 g、黄连 6 g、清半夏
10 g、天麻 10 g、干姜 8 g、石菖蒲 8 g、炙甘草 6 g 组
1 材料和方法
成，共71 g，由北京中医药大学东直门医院配制成中
1.1 材料 药配方颗粒。配方颗粒剂生药含量：出膏率=颗粒
1.1.1 试剂及仪器 剂重量（g）/生药重量（g）。小鼠日给药量（g 颗粒/kg
NTQ颗粒购自北京中医药大学东直门医院；Neu⁃ 体重）按临床成人日处方量计算：（g生药/70 kg体重
robasal Medium（Cat：21103049）、DMEM/F ⁃ 12 basic 人）×9.1×出膏率。
（Cat：C11330500BT）、Accutase（Cat：A1110501）（Gibco 1.2.2 实验动物分组
公司，美国）；B27（Cat：17504⁃044，Invitrogen公司，美 将12只2.5月龄5×FAD小鼠随机分为两组：AD
国）；Papain（Cat：A003124）、DNase Ⅰ（Cat：B300065） 组、AD+NTQ 组，每组6只。将NTQ颗粒溶于ddH2O
（上海Sangon公司）；5⁃溴脱氧尿嘧啶核苷（5⁃bromo⁃ 中，按照 2.5 g/kg 的日给药量喂养 AD+NTQ 组小鼠，
2⁃deoxy uridine，BrdU）（Cat：HY⁃15910，MedChemEx⁃ AD组小鼠使用同体积的ddH2O喂养，按小鼠体重进
press公司，美国）；美金刚（Cat：M813353，Macklin 公 行灌胃给药，给药体积为0.1 mL/10 g，连续90 d。
司，美国）；细胞周期依赖性蛋白激酶（cyclin⁃depen⁃ 1.2.3 脑组织的制备
dent kinase，CDK）抑制剂帕布昔利布（palbociclib， AD组、AD+NTQ组小鼠经PBS心脏灌流后剥离
PB）（Cat：S1116，Selleck公司，美国）；一抗：Y染色体 脑组织，用 2%多聚甲醛（paraformaldehyde，PFA）固
性别决定区（sex⁃determing region of Y chromosome， 定后依次经 10%、20%、30% 蔗糖梯度脱水，使用冰
SRY）盒转录因子 2（SRY⁃box transcription factor 2， 冻切片机制备40 μm大脑冠状切片。
SOX2）（Cat：ab97959）、BrdU（Cat：ab6326）（Abcam公 1.2.4 NSC体外分离培养体系
司，美国），GATA 结合蛋白 2（GATA binding protein 孕 C57/BL6J 鼠断颈处死后，取 E15.5 胚胎小鼠
2，GATA2）（Cat：BA0884⁃2，Boster 公司，美国），双皮 剥离脑组织；将组织切碎后加入Papin溶液，在37 ℃
质素（doublecortin，DCX）（Cat：SC⁃8066，Santa Cruz 水浴锅消化5~10 min，去除上清后加适量含DNase Ⅰ
公司，美国），cyclin D1（Cat：55506，Cell Signaling 的DMEM/F⁃12溶液，反复吹打后经细胞筛过滤获得
Technology 公司，美国），p27/Kip1（Cat：256H984X， 细胞悬液；置于悬浮细胞培养板形成神经球后，加
GAB 公司，美国），β⁃actin（Cat：AC026，ABclonal 公 入 Accutase 溶液 37 ℃消化 5 min 后离心收集沉淀，
司，美国）；耐高温全预混第 1 链 cDNA 合成试剂盒 重悬得到单细胞悬液。平铺于多聚 D⁃赖氨酸包被
（Cat：AU341，北京TransGen公司），细胞凋亡试剂盒 的细胞板中，用NTQ或美金刚（1 μmol/L）处理。
（Cat：C1090，上海碧云天公司），CCK⁃8试剂盒（Cat： 1.2.5 免疫荧光染色
CA1210，北京Solarbio公司）。 将脑片或细胞爬片用PBS洗涤3次（每次5 min）
实时荧光定量PCR仪（型号QuantStudio3，Ther⁃ 后，经 4% PFA 固定 10 min，将封闭液（含 1% BSA、
mo Scientific 公司，美国）；多功能酶标仪（型号 Infi⁃ 0.3% Triton X⁃100的PBS）滴加于脑片/细胞爬片上，
nite M200，TECAN公司，瑞士）；蛋白质电泳系统（型 室温封闭1 h后加入稀释好的一抗溶液，4 ℃孵育过
号PowerPac，Bio⁃Rad公司，美国）；冰冻切片机（型号 夜。次日，PBS 洗涤 3 次后，加入荧光标记二抗溶
CM1950，Leica 公司，德国）；倒置激光显微镜（型号 液，避光室温孵育1 h，PBS洗涤3次后，加DAPI溶液
Eclipse Ti⁃U，Nikon公司，日本）。 染色 10 min，加抗荧光淬灭剂封片，利用激光共聚
1.1.2 实验动物 焦显微镜拍照。一抗稀释比例：DCX（1∶500）、
孕15.5 d C57/BL6J小鼠2只购自北京斯贝福生 SOX2（1∶2 000）、BrdU（1∶1 000）。
物技术有限公司。5×FAD 小鼠，雄性，12 只饲养于 1.2.6 RNA提取和实时荧光定量PCR检测
室温（24±1）℃动物房中，12 h 昼夜周期节律，水和 取脑组织或细胞样品，加 TRIzol 溶液后冰上裂
