Page 33 - 南京医科大学自然版
P. 33

第45卷第3期         黎   燕，周克茹，季旻珺，等. 利用反向遗传学技术拯救重组H1N1 pdm09亚型流感病毒［J］.
                  2025年3月                     南京医科大学学报（自然科学版），2025，45（3）：319-326                        ·321 ·


                养箱（赛默飞公司，美国），电泳仪、多功能凝胶图像                         （EPI：1661231）和NA（EPI：1661230）序列，并在5′端
                分析仪（上海天能公司），孵化机（德州科裕孵化设                           添加 5′⁃CCGAAGTTGGGGGGG⁃3′，在 3′端添加 5′⁃
                备公司）。                                             GGCCGCCGGGTTATT⁃3′，基因序列合成由上海欣卓
                1.2  方法                                           生物科技公司进行，测序由安徽通用生物公司进行。
                1.2.1 引物设计和基因合成                                   1.2.2 病毒基因组RT⁃PCR及空载pHW2000线性化
                    IAV 基 因 组 反 转 录 引 物 序 列 为 Unit12：5′ ⁃             按照 FastPure Viral DNA/RNA Mini Kit 说明书
                                                     ®
                AGCRAAAGCAGG ⁃ 3′ ，根 据 ClonExpress Ⅱ One          提取 PR8 病毒的 RNA，使用反转录引物 Unit12 和
                Step Cloning Kit 要求设计 IAV 基因通用扩增引物和               PrimeScrip RT reagent Kit将提取的病毒RNA反转录
                空载 pHW2000 线性化引物（表 1），所有引物由南京                     为 cDNA，以 cDNA 为模板，使用表 1 的 PCR 引物扩
                金斯瑞生物科技公司合成。在全球共享流感数据                             增 PR8 病毒的 8 个基因片段，同时利用反向 PCR 技
                倡议组织（global initiative of sharing all influenza data，  术使pHW2000载体线性化。1%琼脂糖凝胶电泳验

                GISAID）数据库中下载 A/Wisconsin/588/2019 的 HA           证PCR产物，纯化回收PCR产物并测序鉴定。
                                                        表1 PCR引物序列
                                                  Table 1 Primer sequences for PCR
                        Primer                                                 Sequences（5′→3′）
                      PB2⁃F                                       CCGAAGTTGGGGGGGAGCGAAAGCAGGTC
                      PB2⁃R                                       GGCCGCCGGGTTATTAGTAGAAACAAGGTCGTTT
                      PB1⁃F                                       CCGAAGTTGGGGGGGAGCGAAAGCAGGCA
                      PB1⁃R                                       GGCCGCCGGGTTATTAGTAGAAACAAGGCATTT
                      PA⁃F                                        CCGAAGTTGGGGGGGAGCGAAAGCAGGTAC
                      PA⁃R                                        GGCCGCCGGGTTATTAGTAGAAACAAGGTACTT
                      NP⁃F                                        CCGAAGTTGGGGGGGAGCAAAAGCAGGGTA
                      NP⁃R                                        GGCCGCCGGGTTATTAGTAGAAACAAGGGTATTTTT
                      M⁃F                                         CCGAAGTTGGGGGGGAGCAAAAGCAGGTAG
                      M⁃R                                         GGCCGCCGGGTTATTAGTAGAAACAAGGTAGTTTTT
                      NS⁃F                                        CCGAAGTTGGGGGGGAGCAAAAGCAGGGTG
                      NS⁃R                                        GGCCGCCGGGTTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT
                      HA⁃F                                        CCGAAGTTGGGGGGGAGCAAAAGCAGGGGAA
                      HA⁃R                                        GGCCGCCGGGTTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT
                      NA⁃F                                        CCGAAGTTGGGGGGGAGCAAAAGCAGGAGT
                      NA⁃R                                        GGCCGCCGGGTTATTAGTAGAAACAAGGAGTTTTTT
                      pHW2000⁃F                                   AATAACCCGGCGGCCC
                      pHW2000⁃R                                   CCCCCCCAACTTCGGAG

                1.2.3 构建重组质粒                                      DMEM，取 PR8 病毒 6 个内部基因质粒和目标拯救
                    将回收的病毒基因片段和线性化 pHW2000 载                      病毒A/Wisconsin/588/2019的HA、NA质粒各1 μg加
                体按照 ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit 说明书        入 250 μL Opti⁃MEM 中 ，取 16 μL Lipo2000 加 入
                                 ®
                进行重组反应，产物转化至感受态细胞后涂布到含有                           250 μL Opti⁃MEM 中，两者混合室温静置 20 min 后
                氨苄抗性的LB培养板，37 ℃、5%CO2培养16 h，挑取                    均匀滴加至细胞表面，置于 37 ℃、5%CO2培养箱孵
                单菌落进行菌落PCR鉴定，筛选出阳性克隆后送至                           育，转染 6 h 后更换无血清 DMEM，转染后 24 h 更换
                测序，对序列正确的质粒抽提后-20 ℃保存备用。                          含有浓度为2 μg/mL TPCK胰酶的DMEM继续培养，
                1.2.4 病毒拯救                                        转染后72 h收集培养液离心，取一部分上清液用于
                    将293T细胞和MDCK细胞以4.5∶1的比例平铺                     后续实验，其余置于-80 ℃冰箱保存备用。
                六孔板中并置于 37 ℃、5%CO2培养箱孵育，待细胞                       1.2.5 被拯救病毒鉴定
                汇合 80%~90%时转染。转染前 2 h 更换无血清                           按照全国流感监测技术指南红细胞凝集实验
   28   29   30   31   32   33   34   35   36   37   38