Page 34 - 南京医科大学自然版

第45卷第3期
·322 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2025年3月

的方法测定转染 72 h 后上清液的被拯救流感病毒 1.2.8 病毒小鼠致病性评价及半数致死量（median
血凝效价。用试剂盒提取转染上清液中被拯救病 lethal dose，LD50）测定
毒的 RNA，RT⁃PCR 后 1%琼脂糖凝胶电泳验证产 将 10~12 周龄雌性 BALB/c 小鼠随机分为 4 组，
物，胶回收纯化HA、NA片段后测序鉴定。 每组 5 只。0.45 μm 滤膜过滤病毒尿囊液后用 PBS
1.2.6 病毒在MDCK细胞上的生长曲线测定 将病毒液以 10 倍梯度稀释，稀释比依次为 1∶1、
将被拯救病毒以 MOI=0.1 接种 MDCK 细胞，于 1∶10、1∶100，对照组为 PBS。小鼠按照体重注射三
37 ℃、5%CO2 细 胞 培 养 箱 中 孵 育 2 h，更 换 含 有 溴乙醇后每组每只滴鼻 50 μL 病毒液，观察小鼠每
浓度为 2 μg/mL TPCK 胰酶的 DMEM 继续培养，观 天状态，当小鼠体重下降至滴鼻前体重的75%时判
察细胞病变情况，于12、24、36、48、60、72 h收取上清 定为死亡并立即执行安乐死 ［12］ ，记录滴鼻后14 d小

液进行半数组织培养感染剂量（50% tissue culture 鼠的体重变化情况和死亡情况并绘制小鼠体重变
infective dose，TCID50）测定，每个时间段测 3 个平行 化曲线和生存曲线。
孔，绘制病毒在 MDCK 细胞上的生长曲线，判断该 1.3 统计学方法
病毒在MDCK细胞上的最佳生长时间。 使用 GraphPad Prism 9 软件进行数据统计并绘
1.2.7 病毒的鸡胚扩增 制病毒生长曲线、小鼠体重变化曲线和生存曲线。
将转染72 h后的上清稀释10倍后接种9~10日 计量资料用均数±标准差（x ± s）表示。

龄SPF级鸡胚尿囊腔，每枚100 μL，置于37 ℃、60%
2 结 果
湿度的孵化箱中培养，在24、48、72、96、120、144 h每
个时间点取3枚接种后的鸡胚收取尿囊液测定其血 2.1 病毒基因组RT⁃PCR及pHW2000线性化结果
凝效价，判断被拯救病毒在鸡胚上的适应性，将血凝 PR8 病毒 8 个基因片段 PCR 及 pHW2000 线性
效价高的病毒尿囊液 4 ℃、3 500 r/min 离心 20 min， 化结果见图 1，条带大小正确，胶回收后测序结果
-80 ℃冰箱保存。 正确。

A B
Marker pHW2000
Marker NS M NA NP HA PA PB1 PB2 Marker
bp bp
5 000— 5 000—
3 000— 3 000— —2 961 bp
2 000— 2 000—
1 500— 1 500—
1 000— 1 000—
750— 750—
500— 500—
250— 250—
100— 100—

A：Amplification of gene segments from PR8 by RT⁃PCR. The length of NS=890 bp，M=1 027 bp，NA=1 412 bp，NP=1 565 bp，HA=1 778 bp，
PA=2 233 bp，PB1=2 341 bp，PB2=2 341 bp. B：Linearization of pHW2000 by PCR. The length of pHW2000=2 961 bp. Marker：DL 5 000 DNA marker.
图1 PR8基因片段扩增及pHW2000线性化结果
Figure 1 Amplification of gene segments from PR8 and linearization of pHW2000

2.2 重组质粒构建结果 图2C所示。
PR8病毒8个基因片段重组质粒电泳结果见图 2.3 病毒拯救结果

2A，条带位置正确，测序结果正确。A/Wisconsin/ 以“6+2”模式将构建的 PR8 病毒 6 个内部基
588/2019的HA 片段中有影响大肠杆菌生长的有毒 因重组质粒与 HA、NA 重组质粒共转染 293T 与
序列，将重组质粒转化至大肠杆菌后，大肠杆菌几 MDCK细胞，同时另转染 PR8 病毒 8 个基因重组质

乎不生长，将非编码区替换为 A/California/07/2009 粒作为阳性对照，72 h 后取上清液测定血凝效
（H1N1）病毒的非编码区，得到的重组质粒转化至大 价。阳性对照 PR8 病毒血凝效价为 1∶32，目标拯

肠杆菌后，大肠杆菌可正常生长（图 2B）。A/Wis⁃ 救病毒 A/Wisconsin/588/2019 血凝效价为 1∶8（图
consin/588/2019 的 HA 和 NA 重组质粒电泳结果如 3A）。提取上清病毒 RNA 对其中 HA、NA 片段进