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第45卷第3期
               ·320 ·                            南 京    医 科 大 学 学         报                        2025年3月


              expected results. Most MDCK cells were completely shed at 72 hours after inoculation with the recombinant virus，and its viral titer was
                                                                                               8
                5.38
              10 TCID50/mL. The peak of replication was 60 hours after inoculation. The hemagglutination titer reached 1∶2 on eggs. All BALB/c
              mice died on the 8th day after intranasal administration of the recombinant virus with a dilution ratio of 1∶1，and the median lethal dose
              of the recombinant virus to mice was 10 -1.38 /50 μL. Conclusion：A recombinant H1N1 pdm09 virus is successfully rescued. The virus
              grows well in MDCK cells and has good egg⁃adaptation. It is also pathogenic and lethal in mice. This study provides a new idea for the
              rapid rescue of influenza viruses by reverse genetics method.
             ［Key words］ seasonal influenza；H1N1；reverse genetic technology
                                                                            ［J Nanjing Med Univ，2025，45（03）：319⁃326］





                  季节性流感主要发生在冬季，是由流感病毒引                          种可选择的方法，可在更短时间内产生指定基因组
              起的急性呼吸道传染性疾病。据世界卫生组织（简                            合的流感疫苗株        ［11］ 。此外反向遗传学技术可对病
              称 WHO）统计，全球每年约有 10 亿季节性流感病                        毒基因组进行修饰或改造，如基因点突变、插入、缺

              例，其中包括 300 万~500 万重症病例，导致 29 万~                   失及置换等，产生具有指定变异的病毒粒子，以用
              65 万病例死亡 。流感病毒根据核蛋白和基质蛋白                          于病毒的致病性、复制调控、遗传进化和宿主适应
                           ［1］
              的抗原性分为甲、乙、丙、丁4种类型，其中甲型流感                          性等基础研究。
                                                         ［2］
              病毒（influenza A virus，IAV）能引起流感大流行 ，                    IAV 存在复杂的RNA 二级结构，其反向遗传拯
              高峰期给人类医疗体系带来巨大负担。                                 救难度较其他病毒增加。影响IAV拯救成功率的实
                  IAV 是负性分节段RNA 病毒，完整的病毒粒子                      验因素众多，且不同亚型的 IAV 拯救成功率相差
              包含 8 个基因片段，每个基因片段包括两端影响病                          较大，即使拯救成功也存在不能正常生长的缺陷病
              毒组装和复制的非编码区和编码病毒蛋白的编码                             毒 。本研究利用反向遗传学技术，以PR8病毒内部
                                                                  ［8］
                ［3］
              区 ，8个片段分别编码血凝素（hemagglutinin，HA）、                 基因为骨架，2021—2023 年北半球候选疫苗株 A/
              神 经 氨 酸 酶（neuraminidase，NA）、碱 性 聚 合 酶 1           Wisconsin/588/2019（H1N1）的 HA、NA 为表面抗原，
             （polymerase basic 1，PB1）、碱性聚合酶 2（polymerase        通过非编码区的更换，成功拯救一株重组 H1N1
              basic 2，PB2）、酸性聚合酶（polymerase acidic，PA）、         pdm09病毒，为H1N1疫苗株的快速制备提供新思路。
              核蛋白（nucleoprotein，NP）、基质蛋白（matrix protein，
                                                                1  材料和方法
              M）和非结构蛋白（non⁃structural protein，NS），其中
              HA 和 NA 是IAV表面抗原蛋白，负责病毒感染和释                       1.1  材料
              放，决定病毒亚型        ［4-5］ 。目前人群中流行的IAV亚型                   293T细胞、MDCK细胞、PR8毒株和用于流感病
              是H1N1和H3N2，最近一次流感大流行在2009年由                       毒拯救的双向表达载体pHW2000由中科南京生命健
              H1N1引起，由于H1N1取代了之前传播的病毒，因此                        康高等研究院提供。DH5α和Stbl3感受态细胞（上海
              2009 年之后的 H1N1 病毒也被称作 H1N1 pdm09 。                昂羽生物公司），SPF 级鸡胚（江苏勃林格殷格翰公
                                                         ［6］
              IAV易发生抗原漂移和抗原转换，变异和传播速度非                          司），10周龄雌性SPF级BALB/c小鼠（浙江维通利华
              常快，接种疫苗是预防季节性流感的最佳方法                   ［7-8］ 。    公司）。所有动物实验经中科南京生命健康高等研究
                  反向遗传学技术是一种新兴的分子生物学技                           院动物伦理委员会审批通过（2406001）。
              术，可在获得病毒核苷酸序列信息的基础上，将病                                 FastPure Viral DNA/RNA Mini Kit、FastPure Gel
              毒cDNA克隆于细菌质粒后转染合适的细胞，从而拯                          DNA Extraction Mini Kit 和 ClonExpress Ⅱ One Step
                                                                                                  ®
              救具有感染性的病毒粒子 。季节性流感疫苗株需                            Cloning Kit（南京诺唯赞公司），PrimeScrip RT reagent
                                     ［9］
              要根据流行情况进行更新，传统的疫苗生产方法为遗                           Kit 和 PrimeSTAR HS DNA Polymerase（Takara 公司，

              传重配法，通常是将高产毒株 A/Puerto Rico/8/1934                日 本），NucleoBond Xtra Midi（MN 公 司 ，德 国），
             （简称PR8）与野生型毒株混合感染使毒株间发生基                           0.25% Trypsin⁃EDTA、Fetal bovine serum、Penicillin⁃
              因片段交换造成重配，用特异方法筛选出含有野生                            streptomycin、DMEM、Opti ⁃ MEM、Lipofectamine   TM
              型毒株免疫原性基因片段的重配毒株，此过程耗时                            2000 Reagent（赛默飞公司，美国），Trypsin（TPCK⁃
              且不可预测     ［10］ ，相比之下反向遗传学技术显然是一                   Treated）（上海懋康生物）。梯度PCR仪、恒温CO2培
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