Page 35 - 南京医科大学自然版

第45卷第3期 黎 燕，周克茹，季旻珺，等. 利用反向遗传学技术拯救重组H1N1 pdm09亚型流感病毒［J］.
2025年3月 南京医科大学学报（自然科学版），2025，45（3）：319-326 ·323 ·

A
pHW⁃PB2
pHW⁃NS pHW⁃M pHW⁃NA pHW⁃NP pHW⁃HA pHW⁃PA pHW⁃PB1
M M
bp
11 849—
10 085—
8 023—
6 133—
5 026—
3 997—
3 049—
2 087—

B C C
pHW⁃wNA pHW⁃wHA
A/Wisconsin/588/2019 A/California/07/2009 M M
bp
11 849—
10 085—
8 023—
6 133—
5 026—
3 997—
3 049—
2 087—

A：Electrophoretic image of eight gene segments recombinant plasmids of PR8. The length of pHW⁃NS=3 851 bp，pHW⁃M=3 988 bp，pHW⁃NA=
4 373 bp，pHW⁃NP=4 526 bp，pHW⁃HA=4 739 bp，pHW⁃PA=5 194 bp，pHW⁃PB1=5 302 bp，pHW⁃PB2=5 302 bp. B：Transformation of HA recombi⁃
nant plasmid into E.coli. C：Electrophoretic image of HA and NA recombinant plasmids of A/Wisconsin/588/2019. The length of pHW⁃wNA=4 419 bp，
pHW⁃wHA=4 738 bp. M：Supercoiled DNA marker.
图2 重组质粒构建结果
Figure 2 Construction of recombinant plasmids

行 RT⁃PCR（图 3B），测序后序列比对正确，说明病 A 1∶2 1∶4 1∶8 1∶16 1∶32 1∶64
毒拯救成功。
PR8
2.4 病毒在MDCK细胞和鸡胚上的生长曲线
将被拯救病毒转染后上清液接种 MDCK 细胞， A/Wisconsin/588/2019
观察细胞病变，部分细胞在 48 h 后变圆、皱缩，72 h
Negative
后大部分细胞完全脱落（图 4A）。收获上清液测定
B M NA HA M
5.38
病毒滴度为10 TCID50/mL，说明该重组病毒A/Wis⁃ bp
5 000—
consin/588/2019 在 MDCK 细 胞 上 生 长 良 好 。 以 3 000—
MOI=0.1的病毒量感染MDCK细胞并在不同时间段 2 000—
1 500—
收集上清测定 TCID50，绘制病毒 A/Wisconsin/588/
1 000—
2019在MDCK上的生长曲线（图4B），重组病毒在感 750—
500—
染 MDCK 细胞 60 h 后复制达到高峰。将稀释后的
A/Wisconsin/588/2019 病毒液接种鸡胚尿囊腔后于 250—
100—
不同时间段测定血凝效价（图4C），重组病毒A/Wis⁃
consin/588/2019在接种鸡胚后的血凝效价最高可达 A：Hemagglutination test of recombinant A/Wisconsin/588/2019.
B：PCR identification results of HA and NA of recombinant A/Wiscon⁃
1∶2 ，提示重组病毒具有良好的鸡胚适应性。
8
sin/588/2019. The length of NA=1 458 bp，HA=1 777 bp. M：DL 5 000
2.5 病毒对小鼠的致病性评价及LD50测定 DNA marker.
小鼠滴鼻后记录体重变化（图5A），实验组小鼠 图3 重组A/Wisconsin/588/2019病毒鉴定结果
从滴鼻后第2天开始出现食欲不振，体重下降，行动 Figure 3 Identification results of recombinant A/Wiscon⁃
迟缓等症状，且病毒稀释比为 1∶1 组小鼠在滴鼻后 sin/588/2019

第8天全部死亡（图5B），说明重组A/Wisconsin/588/ 2019 对小鼠具有致病性和致死性。计算该病毒的