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第45卷第3期 宗益平，张俊麒，王子杰，等. 广金钱草总黄酮抑制M1型巨噬细胞极化减少小鼠肾草酸钙结石形成［J］.
2025年3月 南京医科大学学报（自然科学版），2025，45（3）：327-333 ·329 ·

预（30 μg/mL）24 h。 1.3 统计学方法
1.2.2 HE染色 所有资料均采用 SPSS 17.0 进行分析。定量资
收集各组小鼠在建模第28天的肾脏，并分别置 料采用均数±标准差（x ± s）表示，两组之间的比较采
于石蜡固定及液氮保存。肾组织经石蜡固定、HE 用t检验，多组间比较采用方差分析，进一步两两比
染色后，在倒置显微镜下随机选取5个视野拍照，比 较采用LSD⁃t法。P < 0.05为差异有统计学意义。
较各组小鼠肾组织中草酸钙结晶的数量以及肾脏
2 结 果
形态的变化。在此基础上，将各组 HE 染色切片转
至偏振光显微镜下，调整偏光装置及染色焦距后， 2.1 TFDS 通过抑制 M1 型巨噬细胞极化减少肾草
观察各组肾脏组织 HE 染色切片中晶体分布及数 酸钙结石形成
量，并通过晶体的分布观察结果，随机选择5个视野 与 Rictor Cre +EG 组相比，Rictor Cre +EG 组
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+
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拍照并行半定量分析。 小鼠肾组织中肾草酸钙结晶形成显著增多，提示选
1.2.3 RT⁃PCR检测 择性敲除小鼠巨噬细胞内Rictor可显著促进肾草酸
分别收集各组细胞，提取总 RNA，并按试剂盒 钙结晶形成；TFDS 干预小鼠后，TFDS+Rictor Cre +
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说明书制成 cDNA。取 2 μL cDNA 产物、SYBR 预混 EG 组的肾组织中肾草酸钙结晶比 Rictor Cre +EG
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液 16 μL、上下游引物各 1 μL，共计 20 μL 总反应体 组明显变少，提示 TFDS 可在小鼠体内显著抑制肾
系进行RT⁃PCR。引物序列见表1。以 GAPDH 作为 草酸钙结晶形成（图 1A~C）。与 Rictor Cre +EG 组
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+
内参，用 GAPDH 的 Ct 归一目标基因的 Ct 得ΔCt，其 相比，TFDS+Rictor Cre +EG 组的肾组织中草酸钙
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+
次用校准样本的ΔCt归一样品的ΔCt，最后计算表达 结晶未出现显著变化，提示 TFDS 抑制肾草酸钙结
水平比率：2 -ΔΔCt =表达量的比值。 晶可能与抑制小鼠巨噬细胞内 Rictor 有关。此外，
4 组小鼠的肾功能并未出现明显差异（图1D、E）。
表1 引物序列 为探讨 TFDS 对抑制肾草酸钙结石形成的机
Table 1 Primer sequences
制，对各组小鼠肾组织进行了免疫荧光染色和组织
Gene Primer sequence（5′→3′）
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流式细胞术检测。结果如图2所示，Rictor Cre +EG
GAPDH Forward：GAAGGTCGGTGTGAACGGAT
组的小鼠肾组织中 F4/80 iNOS 巨噬细胞散在分
+
+
Reverse：CCCATTTGATGTTAGCGGGAT
布 于 间 质 ，而 Rictor Cre +EG 组 小 鼠 肾 组 织 中
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iNOS Forward：TCCCGAAACGCTACACTTCC
F4/80 iNOS 巨噬细胞广泛分布于肾间质中，其表达量
+
+
Reverse：CGGCTGGACTTCTCACTCTG
显著高于Rictor Cre +EG组；而两组F4/80 CD206 巨
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1.2.4 免疫荧光染色 噬细胞的表达量没有明显差异（图 2A、B）。相比
取上述固定的组织切片或细胞，加入破膜工作 Rictor Cre +EG组，TFDS+Rictor Cre +EG 组的肾组
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液进行破膜。用 3%BSA 滴加以确保均匀覆盖组 织中 F4/80 iNOS 巨噬细胞的分布显著降低；与
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织封闭 30 min。一抗（F4/80，1∶100 稀释；CD206， Rictor Cre +EG 组相比，TFDS+Rictor Cre +EG 组
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+
+
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1∶100稀释；iNOS，1∶100稀释）孵育过夜；后将二抗 的肾组织中F4/80 iNOS 巨噬细胞、F4/80 CD206 巨噬
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+
+
按 1∶200 稀释并孵育 50 min。采用 DAPI 复染细胞 细胞未出现明显变化（图2A、B）。此外，组织流式细
核后封片，将完成封片的切片转移至倒置荧光显微 胞术的结果显示，肾草酸钙结石组肾组织的 F4/80 +
镜下观察。 iNOS 数量显著低于Rictor Cre +EG 组，差异有统计
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+
1.2.5 肾组织及细胞的流式细胞术 学意义（P < 0.05）；TFDS 干预后，Rictor Cre +EG 组
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取各组小鼠肾组织，制备成单细胞悬液，将单 小鼠肾组织的F4/80 iNOS 数量亦出现明显下降（P <
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细胞悬液或培养细胞加入流式管内，向每管中加入 0.01）；此外，Rictor Cre +EG 组的小鼠接受TFDS干
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200 μL IC fixation buffer，4 ℃避光孵育 20 min，随后 预后，肾组织的 F4/80 iNOS 数量亦出现明显变化
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+
用 2 mL 破膜液洗 2 次，100 μL 破膜液重悬细胞，向 （P < 0.01，图2C、D），提示TFDS减缓肾草酸钙结石形
每管中分别加入 F4/80、iNOS、CD206 等流式抗体， 成可能与抑制M1型巨噬细胞极化有关。
混匀后 4 ℃ 避光孵育 30 min，破膜液洗2次，PBS 缓 2.2 TFDS依赖Rictor调控的M1型巨噬细胞极化减
冲液洗 1 次，将细胞悬液过滤后上机。流式数据使 少肾草酸钙结石形成
用FlowJo v10进行分析。 为进一步探讨 TFDS 减缓肾草酸钙结石形成