Page 64 - 南京医科大学自然版
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第45卷第4期
               ·500 ·                            南 京    医 科 大 学 学         报                        2025年4月


              胞从组织块周围爬出，并逐渐伸展变成长梭形。待                            储存在-80 ℃备用，根据说明书使用人溶血磷脂酸
              细胞密度长至80%左右，进行传代纯化，将第3~8代                         ELISA试剂盒测定血浆及细胞上清中LPA的含量。
              的细胞用于实验。                                          1.2.6  免疫荧光
              1.2.3  蛋白质免疫印记实验                                       4%多聚甲醛固定细胞，随后利用0.1% Triton⁃X
                  根据目的蛋白分子量配制适宜浓度的 SDS⁃                         孵育 20 min 通透细胞。接着，用 10%山羊血清封闭
              PAGE 凝胶，上样后浓缩胶 80 V，分离胶 120 V 恒压                  1 h后，将细胞置于一抗溶液中4 ℃孵育过夜，第2天
              电泳。将PVDF膜在无水乙醇中浸泡激活，冰浴状态                          避光条件下使用标记有Alexa Fluor 488的二抗室温孵
              下 250 mA 恒流转膜（根据分子量大小确定转膜时                        育1 h，或根据说明使用TSA多重免疫荧光试剂盒进
              间），5%脱脂牛奶封闭过夜，根据说明书配制相应的一                         行多重免疫荧光染色，随后，DAPI溶液孵育10 min进
              抗溶液，4 ℃孵育过夜。第2天于TBST中漂洗10 min，                    行细胞核染色。最后，使用荧光显微镜拍摄图像。
              重复 3 次；室温下孵育二抗（浓度 1∶10 000）2 h；                   1.2.7  划痕实验
              TBST 中漂洗 10 min，重复 3 次；使用天能凝胶成像                        采用伤口愈合实验检测细胞迁移能力，将 HIF
              系统进行曝光显影。                                         以1×10 个/孔的密度接种在6孔板中，培养至80%~
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              1.2.4  实时荧光定量PCR（qRT⁃PCR）                         90%融合后用 200 μL 枪头在 6 孔板中划 3 条竖线。
                  利用TRIzol将结肠组织或细胞裂解，利用氯仿、                      用 PBS 洗去漂浮细胞，观察12~48 h，记录划痕愈合

              异丙醇等溶剂提取RNA并检测浓度，根据qRT⁃PCR                        情况。
              试剂盒操作说明逆转录合成cDNA。引物由擎科生                           1.2.8 RNA⁃seq
              物科技有限公司进行合成，相关引物序列如下：                                  用 100 ng/mL 的 AREG 刺激人肠成纤维细胞
              GAPDH（human）上游引物：5′⁃CACCATCTTCCAGG                48 h（每组 3 个重复样本）。然后，TRIzol 分别分离
              AGCGAG⁃3′下游引物：5′⁃GATGGCATGGACTGTG⁃                和裂解 AREG 处理组及对照组细胞，收集后送样。
              GTCA⁃3′；Col1a1（human）上游引物：5′⁃GAGGGC⁃              由华大基因测序公司进行RAN⁃seq及进行数据分析。
              CAAGACGAAGACATC⁃3′，下游引物：5′⁃CAGAT⁃                 1.2.9  细胞转染
              CACGTCATCGCACAAC⁃3′；Col6a1（human）上游引                   将人肠成纤维细胞接种6孔板中，待细胞生长至
              物：5′⁃ACAGTGACGAGGTGGAGATCA⁃3′，下游引物：               70%~80%密度时根据说明书使用Lipo⁃3000试剂盒
              5′⁃GATAGCGCAGTCGGTGTAGG⁃3′；Col6a3（human）          进行转染，在培养箱中培养48 h后进行下一步实验。
              上游引物：5′⁃ATGAGGAAACATCGGCACTTG⁃3′，下                1.3  统计学方法
              游引物：5′⁃GGGCATGAGTTGTAGGAAAGC⁃3′；LP⁃                    实验数据使用 GraphPad Prism 9 软件进行统计
              AR1（human）上游引物：5′⁃GCTGCCATCTCTACTTC⁃              学分析及作图，计量数据用均数±标准差（x ± s）表
              CATC⁃3′，下游引物：5’⁃AAGCGGCGGTTGACATAG⁃               示，两样本均数比较采用独立样本t检验，多组样本
              ATT⁃3′；LPAR2（human）上游引物：5′⁃ACAGCCC⁃               均数比较采用单因素方差分析。P < 0.05为差异有
              GACTTTCACTTGAG⁃3′，下游引物：5′⁃GCCCACAAT⁃              统计学意义。
              GAGCATGACCA；LPAR3（human）上游引物：5′⁃GCT⁃
                                                                2 结     果
              GCCGATTTCTTCGCTG⁃3′，下游引物：5′⁃AGCAGT⁃
              CAAGCTACTGTCCAG⁃3′；LPAR4（human）上游引                2.1  AREG上调人肠成纤维细胞LPAR3的表达
              物：5′⁃TCCTTACCAACATCTATGGGAGC⁃3′，下游引                    为探究 AREG 在 CD 相关肠纤维化发生及发

              物：5′⁃ACGTTTGGAGAAGCCTTCAAAG⁃3′；LPAR5              展中作用及潜在机制，将人肠成纤维细胞分为对照
             （human）上游引物：5′⁃CAGAGGGCAAATGGGACA⁃                 组及 AREG 处理组，通过 RNA⁃seq 进行转录组学测
              GA⁃3′，下游引物：5′⁃TGGGTAGGTCGGTAGTCAGG；               序，根据差异倍数绝对值|log2 （Control/AREG）|>2，

              LPAR6（human）上游引物：5′⁃TTGTATGGGTGCAT⁃               Q 值< 0.01 作为筛选标准，共发现差异表达基因 74
              GTTCAGC⁃3′，下游引物：5′⁃GCCAATTCCGTGTTGT⁃              个。利用火山图及热图分析了两组间的差异表达
              GAAGT⁃3′。                                         基因（图 1A、B），在上调的基因中 LPAR3 上调倍数

              1.2.5  ELISA                                      显著。LPAR3是LPA的特异性受体之一，既往研究
                  收集细胞上清或采用EDTA作为抗凝剂采集血                         提示LPAR3与肺纤维化         ［19］ 、肾纤维化  ［20］ 等纤维化疾
              样。4 ℃、1 000 r/min离心15 min。收集上清并将其                 病的发病相关，随后通过qRT⁃PCR比较了其他亚型
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