Page 63 - 南京医科大学自然版
P. 63

第45卷第4期         林俊杰，王 舒，赵小静，等. 双调蛋白通过上调LPA⁃LPAR3调控肠成纤维细胞活化促进克
                  2025年4月              罗恩病肠纤维化［J］. 南京医科大学学报（自然科学版），2025，45（4）：498-508                   ·499 ·


                strategy for managing intestinal fibrosis.
               ［Key words］ amphiregulin；Crohn’s disease；intestinal fibrosis；lysophosphatidic acid
                                                                              ［J Nanjing Med Univ，2025，45（04）：498⁃508］







                                                                              ［16］
                    克罗恩病（Crohn’s disease，CD）是一种病因不                维细胞的增殖 ，基于此，本研究探讨了AREG⁃LPA⁃
                明的慢性非特异性、胃肠道肉芽肿性炎性疾病，可                            LPAR3在CD肠纤维化发生和发展中的作用及潜在
                发生在胃肠道任何部位，以透壁性炎症为特征，具                            机制，为肠纤维化的治疗提供新思路。
                                        ［1］
                有复发性、进展性和致残性 ，持续存在或反复发生
                                                                  1 材料和方法
                的慢性炎症可引起肠纤维化。肠纤维化是CD最常
                见的并发症之一，超过 50%的 CD 患者由于肠纤维                        1.1  材料
                                                     ［2］
                化导致肠腔狭窄，甚至梗阻，需要手术治疗 。尽管                           1.1.1  临床标本
                目前生物制剂已广泛应用于临床，但有效防止和逆                                本研究使用的狭窄部位及其配对的非狭窄部
                转肠道纤维化的治疗手段仍十分匮乏，探究肠纤维                            位的肠道全层组织样本来自2022年12月—2023年
                化的发病机制将为寻求新的治疗靶点提供思路 。                            12月在南京医科大学第一附属医院因CD肠纤维化
                                                        ［3］
                    研究表明，包括间质细胞、细胞因子、微生物产                         并发肠梗阻行手术治疗的 10 例 CD 患者，本研究经
                物和肠系膜脂肪细胞在内的许多因素共同参与了                             医院伦理委员会批准（伦理号：2023⁃SR⁃852）。样本
                肠道纤维化的发生和发展 。其中，成纤维细胞和                            保存于-80 ℃冰箱或固定于 4%多聚甲醛溶液中以
                                       ［4］
                肌成纤维细胞等间质细胞数量增加以及细胞外基                             备后续实验使用。
                质（extracellular matrix，ECM）过度沉积是肠道纤维              1.1.2  实验试剂
                化的典型特征，成纤维细胞和肌成纤维细胞在多种                                胎牛血清（浙江美森公司）；DMEM 高糖培养
                细胞因子作用下分泌大量的ECM 。                                 基、0.25%胰蛋白酶、链霉素、青霉素、ECL 显影液
                                             ［5］
                    双调蛋白（amphiregulin，AREG）是表皮生长因                （北京Biosharp公司）；TRIzol（Invitrogen公司，美国）；
                                    ［6］
                子家族的主要配体之一 ，可由成纤维细胞、T细胞、                          RT⁃qPCR试剂（南京诺唯赞公司）；GAPDH、LPAR3、
                内皮细胞和巨噬细胞等多种细胞分泌                   ［7-8］ 。AREG    Anti ⁃ Mouse IgG ⁃ HRP、Anti ⁃ Rabit IgG ⁃ HRP 抗 体
                参与细胞增殖、凋亡、分化等多种病理生理过程，促                          （Proteintech公司，美国）；α⁃SMA（Santa公司，美国）；
                进特发性肺纤维化 、肾纤维化              ［10］ 和肝纤维化 等          autotaxin（苏州Immunoway公司）；Ki67（Abcam公司，
                                                          ［7］
                                 ［9］
                慢性纤维化疾病的发生发展。笔者课题组的前期                             美国）；AREG、LPA、Ki16425（MCE 公司，美国）；人
                研究表明，AREG在CD合并肠纤维化患者的肠组织                          溶血磷脂酸 ELISA 试剂盒（上海恒远公司）；TSA 多
                中表达水平增高，并且促进人肠道成纤维细胞增                             重免疫荧光试剂盒（北京多玛克公司）；山羊血清
                殖、活化、迁移和 ECM 的产生          ［11］ ，AREG 在 CD 相关     （北京Biosharp公司）。
                的肠纤维化的发生和发展中起着一定作用，但具体                            1.2 方法
                机制有待进一步探究。                                        1.2.1  结肠组织马松染色纤维化指数评分
                    本研究利用 AREG 处理人结肠成纤维细胞后，                           具体评分标准为：0 分，纤维化局限于黏膜下
                通过 RNA⁃seq 进行转录组学测序，发现包括溶血磷                       层；1 分，保留各层组织结构的大量黏膜下纤维化；
                脂酸受体3（lysophosphatidic acid receptor 3，LPAR3）     2分，大量跨壁纤维化伴正常组织结构消失 。
                                                                                                        ［17］
                在内的基因存在差异表达。LPAR3 是溶血磷脂酸                          1.2.2 人结肠成纤维细胞（human intestinal fibroblast，
               （lysophosphatidic acid，LPA）的特异性受体之一，而              HIF）提取及培养
                                                 ［12］
                LPA在多种慢性纤维化疾病，如肺纤维化 、肾纤维化                  ［13］       参考文献［18］，收集肠道标本后用 PBS 冲洗肠
                和硬皮病中的皮肤纤维化            ［14］ 的发病机制中起着关             道标本数次，以去除肠道内容物及血渍，然后切成
                键作用。CD患者体内存在脂代谢紊乱，包括LPA在                          面积约 1 mm 的碎片。随后，将组织碎片培养在含
                                                                              2
                内的多种脂类物质水平较正常人群升高                  ［15］ ，既往研      有10%胎牛血清、1%青霉素、1%链霉素的DMEM培
                究发现棕榈酸酯等长链脂肪酸可促进人结肠成纤                             养基中，37 ℃含5% CO2条件下培养，4~7 d可见有细
   58   59   60   61   62   63   64   65   66   67   68