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第45卷第6期          高彩月，曹丹丹，倪思琦，等. Akt1上调FBXO6表达对胶质瘤细胞增殖和侵袭的影响［J］.
                  2025年6月                     南京医科大学学报（自然科学版），2025，45（6）：777-785                        ·779 ·


                京诺唯赞生物科技有限公司）。                                    CAGCTTCAGGACACGC⁃3′；下游 5′⁃GGACTTGAG⁃
                1.2  方法                                           GCACATTTCGT⁃3′）；GAPDH（上游 5′⁃GCGTCGC⁃
                1.2.1 数据库分析                                       CAGCCGAG⁃3′；下游 5′⁃TGGAATTTGCCATGGGTG⁃
                    通过 CGGA 数据库（http：//www.cgga.org.cn/）分         GA⁃3′）。提取细胞总 RNA，用 HiScript Ⅱ Q Select
                析胶质瘤患者肿瘤组织中 FBXO6 的表达及其与患                         RT SuperMix for qPCR 试剂盒逆转录为 cDNA，以
                者生存期之间的关系。                                        cDNA 为模板，用 2×Taq Plus Master Mix试剂盒进行
                1.2.2 细胞培养与传代                                     PCR扩增反应，PCR产物用1.5%的琼脂糖凝胶进行
                    将 U251、U373 和 U87 细胞接种于 6 cm 细胞培              电泳（120 V，30 min），进行成像观察。
                养皿中，加入 3 mL 含 10% FBS 的 DMEM 培养基，置                1.2.7 Western blot
                于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱内培养。当细胞融合                           将细胞裂解物煮沸，离心取上清，用10%和12%
                率接近 90%时，用 1 mL 胰蛋白酶消化细胞，接着用                      预制混胶行SDS⁃PAGE电泳，先用50 V恒压浓缩蛋白，
                3 mL 培养基终止消化，经离心后将细胞重悬，再按                         再用120 V恒压分离2 h，接着用0.3 A湿转2 h，待蛋白
                1∶3的比例接种于细胞培养皿，继续培养。                              转印到PVDF膜上后，再用5%脱脂奶粉室温封闭2 h，
                1.2.3 FBXO6过表达质粒的构建                               加入抗 FBXO6、t⁃ERK1/2、p⁃ERK1/2、t⁃JNK、p⁃JNK、
                    FBXO6 过表达质粒（pIRES2⁃FBXO6）由通用生                 t⁃Akt1、p⁃Akt1和β⁃actin的抗体，4 ℃孵育过夜，用1×
                物（安徽）股份有限公司构建，即将目的基因克隆到                           TBST洗涤3次，再加入HRP标记抗兔和抗小鼠二抗，室
                pIRES2⁃EGFP 质粒载体上。经测序鉴定其序列完                       温孵育40 min，洗涤3次，行ECL化学发光试剂检测。
                全正确。将pIRES2⁃FBXO6转染到U87细胞中48 h，                   1.2.8 CCK⁃8实验
                行RT⁃PCR和Western blot检查其表达情况。                          将U87细胞接种于96孔板，同时转染各质粒和
                1.2.4 FBXO6 siRNA的合成和靶点筛选                         siRNA，培养48 h，每孔替换100 μL含10% CCK⁃8的
                    由南京科瑞斯生物科技有限公司设计并合成3个                         DMEM，放置培养箱中，孵育 30 min，用酶标仪测定
                针对FBXO6基因不同靶点的siRNA序列，分别命名                        在450 nm的吸光度。
                为 siFBXO6⁃1（5′⁃GAACAAUGCCACAUGGACATT⁃             1.2.9 Transwell实验
                3′）、siFBXO6⁃2（5′⁃GGCCGGACAUCGUGGUUAATT⁃               将消化下的已转染各质粒和siRNA的U87细胞
                                                                                               5
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                3′）、siFBXO6⁃3（5′⁃CCUCAUGACCCUCUGGAAATT⁃           重悬，调整密度（1.0×10 ~1.5×10 个/mL），取 200 μL
                3′），同时合成对照 siRNA（siNC，5′⁃UUCUCCGAAC⁃              细胞悬液接种于 Transwell 小室，24 孔板下室加入
                GUGUCACGUTT⁃3′）。将siNC、siFBXO6⁃1、siFBXO6⁃2         600 μL含10% FBS的DMEM，放置培养箱中，37 ℃、
                和 siFBXO6⁃3 分别转染 U87 细胞 48 h，收集 RNA 和             5%CO2培养12 h后，弃掉上清液，Transwell小室中加
                蛋白，行 RT⁃PCR 和 Western blot 检查 FBXO6 表达            入600 μL PBS洗涤2次，再加入甲醇固定30 min，用
                量，筛选最佳沉默靶点。                                       PBS洗涤2次，接着加入800 μL结晶紫，染色30 min，
                1.2.5 细胞转染                                        再用PBS洗涤2次。擦去Transwell小室内部未穿出
                    取 1.5 mL EP 管，加入 6 μL Lipofectamine 2000      的细胞，风干至干燥，在正置显微镜下观察，并拍
                和94 μL无血清DMEM，吹打混匀，静置5 min；另取                     照、计数。
                1 个 1.5 mL EP管，加入2 μg质粒或5 nmol siRNA，再            1.3  统计学方法

                加入无血清 DMEM 至 100 μL；将 Lipofectamine 2000              所有实验均独立重复3次，计量资料以均数±标
                加入质粒或siRNA中，吹打混匀，静置15 min；弃掉细                     准差（x ± s）表示。采用 SPSS 20.0 统计软件进行统
                胞培养皿中的DMEM，用PBS清洗，加入1.8 mL无血                      计学分析，两组间比较采用配对t检验，多组间比较
                清DMEM，将静置后的Lipofectamine 2000和质粒混合                则采用单因素方差分析，Bonferroni 法进行两两比
                溶液加入培养皿中，多点加入，轻轻摇晃，使之混匀。                          较，P < 0.05为差异有统计学意义。
                1.2.6 反转录PCR（RT⁃PCR）
                                                                  2  结 果
                    通过 NCBI 数据库查找人 FBXO6 和 GAPDH 基
                因 mRNA 序列，并使用 NCBI 的 Primer⁃BLAST 设计              2.1  胶质瘤患者肿瘤组织和细胞系中 FBXO6 的表
                PCR 引物，由合肥通用生物（安徽）股份有限公司合                         达情况
                成 。 引 物 序 列 如 下 ：FBXO6（ 上 游 5′ ⁃ AGA⁃                 首先使用CGGA数据库分析胶质瘤患者肿瘤组
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