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第45卷第8期 汪 洁，方瑞琪，李 猛，等. Tyro3缺失加重LPS诱导的小鼠内毒素血症［J］.
2025年8月 南京医科大学学报（自然科学版），2025，45（8）：1123-1131 ·1125 ·
皮毛和对刺激的反应进行分级来评估动物的症状， 1.2.4 ELISA
计算 3 次评估的平均值。结膜炎：0 分，闭眼或流泪 按照试剂盒说明检测小鼠血浆TNF⁃α和IL⁃6含
伴有浆液性分泌物；1 分，睁开眼睛有浆液性分泌 量。
物；2分，正常，无结膜炎。粪便：0分，腹泻；1分，稀 1.2.5 HE染色
便；2分，正常粪便。毛皮：0分，未梳理，皮毛粗糙暗 小鼠肝脏经 4%多聚甲醛溶液固定过夜后，石
沉；1 分，梳理减少，毛发粗糙；2 分，有整洁、光泽的 蜡包埋切片，将切片脱蜡至水之后进行苏木素染
皮毛。对刺激的反应：0 分，昏昏欲睡，刺激后仅抬 色，分化和蓝化后进行伊红染色，之后进行脱水和
起头部；1 分，刺激后不活跃，警觉性降低，触碰刺激后 透明化，最后封片，显微镜下观察。
走不到2步；2分，正常的运动和反应，触碰刺激后走 1.2.6 生化检测
步超过2步。总分最高为 8分，表示健康状况正常。 按照制造商的方案，使用生化试剂盒评估小鼠
1.2.3 小鼠造模标本收集 血清AST、ALT、ALP水平，利用酶标仪进行检测。
造模结束后三溴乙醇麻醉小鼠，进行眼球取血 1.2.7 RT⁃qPCR实验
（EDTA抗凝），颠倒混匀，静置，4 ℃离心机3 000 r/min 取少许肝脏组织，TRIzol 提取组织 RNA，测定
离心20 min后，取上清-80 ℃冻存备用，用生理盐水 RNA浓度后，使用逆转录试剂盒将总RNA逆转录为
进行全身灌流后收取小鼠肝脏，部分组织放入液氮 cDNA，通过 RT⁃qPCR 扩增目的基因，GAPDH 作为
罐速冻，-80 ℃保存；部分组织放入 4%多聚甲醛溶 内参，校正每个样本目的基因的 Ct 值，以 2 -ΔΔCt 值表
液中固定。 示基因的相对表达水平，引物序列见表1。
表1 RT⁃qPCR引物序列
Table 1 Primer sequences used in RT⁃qPCR
Gene Forward primer（5′→3′） Reverse primer（5′→3′）
TNF⁃α CAGGCGGTGCCTATGTCTC CGATCACCCCGAAGTTCAGTAG
IL⁃6 TAGTCCTTCCTACCCCAATTTCC TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC
IFN⁃β CAGCTCCAAGAAAGGACGAAC GGCAGTGTAACTCTTCTGCAT
GAPDH TGCGACTTCAACAGCAACTC CTTGCTCAGTGTCCTTGCTG
1.2.8 小鼠BMDM的分离与培养
2 结 果
收集 4 周龄 C57BL/6 雄性小鼠股骨和胫骨，分
离骨髓，将细胞在含有 10% FBS、1%青链霉素、 2.1 LPS 诱导内毒素血症后小鼠肝脏组织 Tyro3 表
M⁃CSF（20 ng/mL）的 RPMI 1640 培养液中培养 7 d， 达降低
每 3 d 更换 1 次培养液，待骨髓前体细胞分化为 为探究 Tyro3 在人脓毒症中的潜在作用，通
BMDM后，用LPS（100 ng/mL）处理细胞。 过 GEO 数据库（GSE54514）对脓毒症幸存患者和
1.2.9 蛋白质免疫印迹实验 对照健康人群全血中 Tyro3 的转录水平进行分
提取小鼠BMDM 蛋白，BCA法测定蛋白浓度并 析。结果发现，与健康对照组相比，脓毒症幸存
定量，每个样品孔上样量为30 μg。随后进行电泳， 患者外周血中 Tyro3 的表达水平显著下调（图 1A），
转膜，封闭，一抗4 ℃冰箱孵育过夜。第2天用TBST 提示 Tyro3 可能在脓毒症病理过程中发挥重要作
缓冲液洗涤 PVDF 膜，室温二抗孵育 1.5 h，洗涤 用。由于内毒素血症被视为脓毒症的亚型或早
PVDF膜后曝片成像。 期阶段，为进一步验证这一发现，取 8 周龄雄性
+/+
1.3 统计学方法 Tyro3 小鼠，随机分为生理盐水对照组和 LPS 处
所有数据使用 GraphPad Prism 9 软件进行数据 理组（10 mg/kg，腹腔注射）。通过 LPS 刺激 12 h
分析，所有数据均以至少3次独立实验的均值±标准 构建小鼠内毒素血症模型，发现 LPS 处理组小鼠
差（x ± s）表示。数据分析采用t检验、单因素方差分 肝脏组织中 Tyro3 蛋白的表达水平较对照组显著
析、双因素方差分析，在双因素方差分析中，小鼠基 降低（图 1B、C）。这一结果与临床数据分析结果
因型和造模处理变量作为两个独立因素纳入模型， 一致，提示 Tyro3 在脓毒症发生发展中可能发挥
P < 0.05为差异有统计学意义。 重要作用。
