Page 19 - 《南京医科大学学报（自然科学版）》2025年第9期

第45卷第9期 张 鸽，陈 昕，顾婧瑶，等. circ_0003633对肺腺癌细胞奥希替尼耐药的作用研究［J］.
2025年9月 南京医科大学学报（自然科学版），2025，45（9）：1229-1241 ·1231 ·

本）提取，用 NanoDrop2000（Thermo Fisher 公司，美 1.2.6 慢病毒感染
国）分析 RNA 浓度。使用 PrimeScript RT 试剂盒 分别构建circ_0003633敲降和过表达慢病毒载
TM
（TaKaRa 公司，日本）进行反转录，采用 SYBR qPCR 体（上海吉玛基因），将待感染细胞铺到6 cm培养皿
Master Mix（湖南艾克瑞生物公司）进行 qRT⁃PCR。 中，待细胞汇合度达 60%~70%时，加入 1 mL 病毒
相对表达量采用 2 -ΔΔCT 法计算。所用引物序列见表1。 液，再加入3 μL聚凝胺，37 ℃孵育48 h后换液，继续

表1 PCR引物序列
Table 1 Primer sequences for PCR
Gene Forward（5′→3′） Reverse（5′→3′）
GAPDH AGAAGGCTGGGGCTCATTTG AGGGGCCATCCACAGTCTC
circ_0003633 GCGCTAGTGATGTGCATTA UAAUGCACAUCACUAGCT
hnRNPA1 GCTCACGGACTGTGTGGTAAT CCTTGTGTGGCCTTGCATTC
GSTA1 GTGCAGACCAGAGCCATTCT GGTGGACATACGGGCAGAG
FOS TGGCGTTGTGAAGACCATGA AGTTGGTCTGTCTCCGCTG
ALDOC CACAGGGAGCTGTCACCAT GGCGGTTCTCCTCTGTGTTT
NPR1 ATCACCGACTATGGGCTGGA TGGAAGACCCCACTCCTCG
NOTCH3 CAGTGTGAACTCCTCTCCCC GGTGCAGATACCATGAGGC
OBSCN CCTGCTAGTGCTGGTGATCC GCTCCAGGGTGGTGTCTTC
ERBB3 TCTTGCCTCGATGTCCTAGC CAGGCCATTCAGAGTCCCG

培养，嘌呤霉素筛选后进行后续实验。
2 结 果
1.2.7 Western blot
将转染 48 h 后的细胞消化后离心，用 PBS 重悬 2.1 circ_0003633在奥希替尼耐药细胞中高表达
后再次离心后弃上清，加入细胞裂解液裂解30 min， 本课题组前期在奥希替尼敏感的EGFR19外显
使用 BCA 法测定总浓度，然后在 SDS⁃PAGE 凝胶电 子缺失突变的肺腺癌细胞系 HCC827 和 EGFR21 外
泳中分离蛋白质样品并湿转到 PVDF 膜上，之后用 显子 L858R 突变以及 T790M 突变的肺腺癌细胞系
5%脱脂奶粉溶液封闭2 h，封闭结束后孵育一抗（抗 H1975中通过奥希替尼药物浓度递增成功诱导了奥
体稀释比1∶1 000），4 ℃摇床过夜，第2天TBST洗膜 希替尼耐药细胞株 HCC827/OR 和 H1975/OR，显微
后与二抗（抗体稀释比1∶10 000）室温孵育1 h，最后 镜下均可观察到同亲本细胞不同的形态，与亲本细
使用ECL发光液在凝胶成像系统中进行曝光。 胞相比，耐药细胞更加扁平并伸出伪足（图1A）。分
1.2.8 RNA pulldown 别检测HCC827、HCC827/OR和H1975、H1975/OR细
RNA pulldown实验参考Pierce 磁性RNA⁃蛋白 胞对奥希替尼的半抑制浓度（IC50值），相比亲本细
TM
pulldown试剂盒说明书，首先RNA探针（50 pmol）和磁 胞，耐药细胞的 IC50 值显著升高（图 1B）。本课题
珠（50 μL）结合，然后再进行RNA⁃蛋白绑定、洗脱，洗 组 前 期 对 HCC827、HCC827/OR 和 H1975、H1975/
脱结束后加入蛋白上样缓冲液进行后续实验。 OR 细胞进行了 circRNA 测序，发现与 HCC827 细胞
1.2.9 银染 相比，circ_0003633 在 HCC827/OR 细胞中显著高表
银染实验参考试剂盒说明书，按照固定、30%乙 达，测序结果已发表 ［14］ 。针对测序结果筛选出的
醇洗脱、水洗涤、增敏、水洗涤、银染、水洗涤、显色、 circ_0003633 进行进一步研究，通过 qRT⁃PCR 验证
终止、水洗涤步骤进行。 circ_0003633在耐药细胞系中显著高表达（图1C）。

1.3 统计学方法 2.2 验证circ_0003633的环状结构
实验数据使用GraphPad Prism软件进行统计分 为了进一步研究 circ_0003633 的相关特性，利
析和绘图。所有数据经正态性检验后以均数±标准 用生物信息学方法（circBase 和 CIRCpedia）进行分
差（x ± s）表示。两组间数据比较采用独立样本 t 检 析，发现circ_0003633是1个796 nt的circRNA，位于

验，多组间样本差异使用单因素方差分析，P < 0.05 3 号染色体，即位于 RYK 基因位点，由其 7~13 号外
为差异有统计学意义。 显子背向剪切形成（图 2A）。使用专门设计用于验