Page 21 - 《南京医科大学学报（自然科学版）》2025年第9期
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第45卷第9期 张 鸽，陈 昕，顾婧瑶，等. circ_0003633对肺腺癌细胞奥希替尼耐药的作用研究［J］.
2025年9月 南京医科大学学报（自然科学版），2025，45（9）：1229-1241 ·1233 ·
显示circ_0003633在细胞质和细胞核中均有分布。 的敲降效率高，后续实验用 1#小干扰序列进行。
2.3 circ_0003633促进耐药细胞增殖迁移及对奥希 在 HCC827/OR 和 H1975/OR 细 胞 中 转 染 si⁃NC 、
替尼耐药 si⁃hnRNPA1⁃1#，CCK⁃8 和集落形成实验结果显示，
为了研究circ_0003633对肺腺癌奥希替尼耐药 与si⁃NC组相比，敲低hnRNPA1后抑制细胞的增殖，
性的影响，设计了特异性小干扰序列（si⁃RNA）。转 联用奥希替尼后，抑制作用更加显著（图 6C、D），
染 HCC827/OR 和 H1975/OR 细胞，qRT⁃PCR 检测细 Transwell 实验结果显示，与 si⁃NC 组相比，敲低
胞中 circ_0036333 的敲降效率，差异有统计学意义 hnRNPA1 后抑制细胞迁移能力，联用奥希替尼后，
（图3A）。si⁃circ_0003633⁃1#敲降效率最高，后续实 细胞的迁移能力进一步下降（图6E）。
验用 1#小干扰序列进行。发现在奥希替尼耐药细 2.5 circ_0003633/hnRNPA1 共同调节 ALDOC 的表
胞中敲低 circ_0003633 的表达，耐药细胞对奥希替 达并参与奥希替尼的耐药过程
尼的 IC50下降 40%（图 3B）。CCK⁃8 实验结果表明， 为了更好地研究circ_0003633参与奥希替尼耐
敲低 circ_0003633 后，HCC827/OR 和 H1975/OR 细 药进展的详细机制，对敲低了 circ_0003633 的奥希
胞的增殖能力都显著下降，敲低 circ_0003633 并联 替尼耐药细胞进行 RNA 测序分析。根据 RNA⁃seq
用奥希替尼后，细胞的增殖能力进一步下降（图 结果，选择表达变化前7位的基因进行进一步研究，
3C），随后集落形成实验也和 CCK⁃8 实验结果一致 通过 qRT⁃PCR 在 HCC827/OR 和 H1975/OR 细胞中
（图3D）。Transwell实验可以反映细胞的迁移能力， 验证7个基因的表达变化，在敲低circ_0003633后的
与转染si⁃NC的细胞相比，敲低circ_0003633后两株 2株细胞中只有ALDOC 同时降低（图7A）。Western
细胞的迁移能力都下降，联用奥希替尼后，细胞的 blot 分析表明，敲低 circ_0003633 后 ALDOC 的蛋白
迁移能力进一步下降（图3E）。 水平也明显下降（图 7B），这与 qRT⁃PCR 结果一致。
接着，构建了 circ_0003633 的全长质粒转染细 稳转细胞中结果与瞬时转染一致（图 7C）。基于以
胞，并通过 qRT⁃PCR 检测过表达效率，其结果差异 上结果，选择ALDOC 作为下游靶基因。ENCORI 网
有统计学意义（图 4A）。随后，集落形成实验表明， 站预测显示，无论是肺鳞癌还是肺腺癌，hnRNPA1与
过表达 circ_0003633 后细胞的增殖能力上升，联用 ALDOC之间相互作用呈正相关（图7D），随后在2株
奥希替尼后，细胞集落形成的数量并无明显差异 细胞系中敲低 hnRNPA1，进行 qRT⁃PCR 和 Western
（图4B）。Transwell实验结果表明，与转染空载的细 blot 实验，结果显示 ALDOC 随着 hnRNPA1 蛋白和
胞相比，过表达 circ_0003633 的细胞迁移能力明显 mRNA水平的下降而下降（图7E、F）。
增加，过表达联用奥希替尼后，对细胞的迁移能力 为了探究 circ_0003633 通过哪些通路发挥作
并无影响（图4C）。 用，根据 RNA⁃seq 结果进行 GO 功能富集分析，发
2.4 circ_0003633 与 hnRNPA1 蛋白相互作用并参 现与 PI3K/AKT 信号通路密切相关（图 8A），通过
与细胞对奥希替尼的耐药过程 Western blot 进行验证，结果发现敲低 circ_0003633
为了进一步分析circ_0003633可能的的下游调 后 PI3K/AKT 通路中的关键蛋白 p⁃PI3K、p⁃AKT 都
控机制，使用靶向circ_0003633的生物素标记探针， 明显下降，联用奥希替尼后，p⁃PI3K、p⁃AKT 的蛋白
进行RNA pulldown实验来寻找与circ_0003633结合 表达进一步下降，而 PI3K 和 AKT 蛋白水平无明显
的蛋白。通过对银染和质谱结果的分析，发现了其 变化（图 8B）。
中一种RNA结合蛋白hnRNPA1（图5A），利用West⁃ 为了继续研究 ALDOC 在奥希替尼耐药细胞中
ern blot 对产物进行验证（图 5B），这些结果表明 的作用，在 HCC827/OR 和 H1975/OR 细胞中敲低
circ_0003633 与 hnRNPA1 结合。Western blot 实验 ALDOC，并利用qRT⁃PCR验证敲降效率，si⁃ALDOC⁃1#
表 明 敲 低 circ_0003633 并 没 有 从 蛋 白 水 平 改 变 敲降效率最高（图9A），后续实验用1#小干扰序列进
hnRNPA1 的表达，这说明 hnRNPA1 与 circ_0003633 行。CCK⁃8和集落形成实验结果表明，敲低ALDOC
的结合并不影响hnRNPA1的表达（图5C）。 后，耐药细胞的增殖能力下降，在敲低 ALDOC 联合
基于以上实验，进一步分析hnRNPA1对奥希替 奥希替尼作用下，细胞增殖能力进一步下降（图9B、
尼耐药性的影响。设计了hnRNPA1的小干扰序列并 C）。Transwell 实验结果显示，与对照组相比，敲低
利用qRT⁃PCR和Western blot验证敲降效率，结果显 ALDOC 后细胞迁移能力下降，联用奥希替尼后，迁
示hnRNPA1明显被敲低（图6A、B）。si⁃hnRNPA1⁃1# 移能力进一步下降（图9D）。
