Page 18 - 《南京医科大学学报（自然科学版）》2025年第9期
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第45卷第9期
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              者的无进展生存期（progression free survival，PFS）和          盒（Cat：K1018，APExBio 公司，美国），SYBR Green
                                        ［4］
              总生存期（overall survival，OS） 。然而，最初对奥希               qPCR 试剂盒（Cat：AG11705，湖南艾克瑞生物有限
              替尼有反应的患者在经历 10.0~18.9 个月的治疗后                      公司）；ECL发光液、BCA蛋白含量检测试剂盒（合肥
                                                      ［5］
              会逐渐出现获得性耐药，致使肿瘤再次进展 。已                            白鲨有限公司）；脱脂奶粉（武汉翌圣生物科技有限
              知 的 各 种 耐 药 机 制 包 括 EGFR 依 赖 性 机 制 如              公司）；辣根过氧化物标记的鼠、兔二抗（武汉三鹰
                                        ［6］
              G719X、G796X、C797S 等突变 ，EGFR 非依赖性机                 有限公司）；奥希替尼（MCE生物科技公司，美国）。
              制如组织学表型转化、旁路途径激活（Met 扩增、                          1.2  方法
              HER2 扩增、IGF1R 激活）、NRAS/KRAS 突变和致癌                 1.2.1 核质分离
                                        ［7］
              融合基因（RET、ALK、BRAF） 。然而，仍有 40%~                         用PBS将细胞清洗2遍，用胰酶进行消化，消化
                                     ［8］
              50%的耐药机制尚不清楚 。因此，明确奥希替尼                           后收集细胞进行离心，结束后弃掉上清，向每个离
              耐药机制对于完善治疗策略和改善预后至关重要。                            心管中加入 300 μL 10%NP⁃40 裂解液，裂解 20 min
                  环状RNA（circRNA）是一种独特的具有闭环的                     后，逐一滴加入 1 mL 的蔗糖 buffer（10%NP⁃40 裂解
                                                    ［9］
              RNA 分子，由前体 mRNA 的反向剪切形成 ，可以                       液体积的 1.5 倍），4 ℃、3 500 g 离心 10 min，吸取上
              作为癌基因或抑癌基因调节各种癌症的发生发                              清（胞质）转移至新的离心管中；使用含 0.5 mol/L
              展，并通过不同的分子机制参与抗癌药物耐药性，                            EDTA的PBS进行清洗，4 ℃、3 500 g离心10 min，重
              包括微小 RNA（micorRNA，miRNA）海绵作用、蛋                    复 2 次，弃掉上清，获得的沉淀即为核沉淀，分别向
              白质相互作用以及转录或转录后调控                    ［10］ 。例如，     细胞核和细胞质的管中加入1 mL TRIzol，按照提取
              circ_0000199 通 过 干 扰 mir ⁃ 206/613 主 导 的 PI3K/    RNA 的方法进行 RNA 提取，使用 qRT⁃PCR 对核质
              AKT/mTOR 信号通路促进三阴性乳腺癌的化疗耐                         进行检测。
              药 ［11］ ，circ_PPAPDC1A 通过海绵 miR⁃30a⁃3p/IGF1R       1.2.2 CCK⁃8实验
              通路促进非小细胞肺癌奥希替尼耐药                   ［12］ 。在人体           将瞬时转染24~48 h后的细胞消化后吹匀，取少
              不同组织中发现了多种类型的 circRNA，表现出高                        量进行细胞计数，根据计数结果，按照每孔2 000个细
              丰度、显著稳定性和组织特异性表达的独特特征。                            胞种入96孔板中，每组4个复孔；根据计算公式配置
              这些特性，加上其在血浆等液体活检样本中的可检                            成细胞悬液，每孔200 μL细胞悬液加入96孔板中，然
              测性，使 circRNA 成为癌症诊断和预后生物标志物                       后6 h后细胞贴壁，按照RPMI1640∶CCK⁃8=9∶1配置
                        ［13］
              的理想选择 。                                           好混合试剂，弃掉培养基，每孔加入100 μL混合试剂，
                  本课题组前期对奥希替尼敏感细胞和耐药细                           放入培养箱等待2 h后，使用分光光度计测量450 nm
              胞进行 circRNA 测序，筛选出差异倍数高的 circ_                    处的吸光度值，连续5 d在同样的时间点进行测定。
              0003633，并进行 qRT⁃PCR 验证，明确 circ_0003633            1.2.3 集落形成实验
              在奥希替尼耐药细胞中上调，且目前尚无关于circ_                              取各组处于对数生长期的细胞，胰酶消化后进
              0003633的生物学功能研究及其参与奥希替尼耐药                         行计数，配制成细胞悬液，按照每孔500个细胞加入
              相关报道。本研究旨在揭示circ_0003633在肺腺癌                      6 孔板中，每孔加入 2 mL 完全培养基，6 孔板置于
              细胞奥希替尼耐药中的作用，期望其能在今后临床                            37 ℃、5%CO2培养箱中培养 2 周。当出现肉眼可见
              治疗过程中成为逆转耐药的潜在靶点。                                 的克隆时，甲醇固定 15 min，用 0.1%结晶紫（Sigma⁃
                                                                Aldrich公司，美国）染色30 min后进行计数。
              1  材料和方法
                                                                1.2.4 Transwell实验
              1.1  材料                                                将瞬时转染 24~48 h 后的细胞消化后吹匀，计
                  HCC827、H1975 细胞（上海中科院细胞所）；                    数后制成细胞悬液，上室每孔 300 μL 细胞悬液，下
              HCC827/OR、H1975/OR 由本课题组诱导；磷脂酰肌                   室加入含10%胎牛血清的条件培养基，37 ℃培养箱
              醇 3 激酶（phosphatidylinositol 3⁃kinase，PI3K）抗体      孵育24 h后，取出小室，用甲醇固定15 min，用0.1%
             （CST 公司，美国）；蛋白激酶 B（protein kinase B，               结晶紫（Sigma⁃Aldrich 公司，美国）染色 30 min 后用

              AKT）抗体（武汉爱博泰克有限公司）；醛糖还原酶C                         棉球擦去内表面细胞，置于显微镜下观察计数。
             （aldolase C）抗体（武汉爱博泰克有限公司）；Tubulin                 1.2.5 实时定量PCR（qRT⁃PCR）
              抗体、β⁃actin抗体（武汉三鹰有限公司）；CCK⁃8试剂                         总 RNA 提取用 TRIzol 试剂（TaKaRa 公司，日
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