Page 27 - 《南京医科大学学报（自然科学版）》2026年第3期
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第46卷第3期 古丽努尔·阿不力米提，凯迪尔耶·阿卜杜萨拉木，陆                     冰，等. CLEC5A在胃癌组织中表达的临床意义及
                  2026年3月      与肿瘤浸润免疫细胞的相关性研究［J］. 南京医科大学学报（自然科学版），2026，46（3）：333-342·335                    ·


                polymer HRP Ms+Rb（Perkin Elmer 公 司 ，美 国）；         中的生物标志物阳性细胞进行定量分析。该系统
                DAPI（Sigma⁃Aldrich 公司，德国）。Opal 7⁃Colour 试         能够通过机器学习算法将扫描图像分割为组织部
                剂盒（Perkin Elmer公司，美国）。                            分和空隙部分，并准确识别和量化这些细胞的表
                1.2  方法                                           型，涵盖整个组织切片的所有高倍视野。
                1.2.1  生物信息学分析                                    1.2.5  免疫组织化学染色评分
                    从癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，                 首先由定量软件（Vectra3.0）进行染色的定量，
                TCGA，https：//cancergenome.nih.gov/）下载胃癌患者         然后由病理学家验证和校正所有评分数据和图
                mRNA 表达阵列数据信息，并使用“limma”包进行标                      谱。将染色强度划分为 0（-，蓝色）、1（+，浅黄色）、
                准化处理。依据RNA序列数据中的CLEC5A表达水                         2（++，棕黄色）和3（+++，棕褐色），染色强度和该强
                平，将肿瘤样本分为CLEC5A mRNA高表达组和低表                       度的细胞所占百分比（0~100%）的乘积为最终得分

                达组。使用 TIMER2.0（http：//timer.comp⁃genomics.       （0~300分）。评分标准包括染色的深浅和阳性区域
                org/）分析CLEC5A mRNA与免疫细胞浸润水平的相                     的面积，确保对不同表达水平的精确区分和定量评

                关性。为了评估 TIL 亚型的差异，使用 CIBERSORT                    估。此方法的高效性和自动化使得对组织芯片上
                通过“limma”包量化22种免疫细胞亚型的比重。                         CLEC5A 表达的评估更加精准，为后续的统计分析

                1.2.2  倾向匹配分析                                     和临床数据的结合提供了可靠的基础。
                    为了减少数据偏差和混杂变量，倾向性匹配性                          1.3  统计学方法
                别、年龄，筛选出胃癌组 36 例和非胃癌组 36 例，对                          用SPSS 22.0软件进行统计分析。用X⁃tile软件
                两组患者CLEC5A蛋白的表达率进行卡方检验。                           根据患者生存状态及生存时间，选取检验结果最小
                1.2.3 免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）染色          P值处CLEC5A蛋白表达值作为高/低表达的截断值
                    将组织芯片置于70 ℃烤片机中烤片90 min，再                     分组进行统计。本研究中以 0~111 分为低或无表
                60 ℃烘片 60 min，二甲苯脱蜡，梯度酒精中水化。                      达，112~300 分为高表达。采用χ 检验对 CLEC5A
                                                                                                 2
                将常规脱蜡后的组织芯片放入微波炉中，变频微                             蛋白表达高低与临床特征之间的关系进行分析；用
                波 20%（2.5 min），变频微波 100%（15 min）进行抗               Cox 回归模型的单因素和多因素分析 CLEC5A 蛋白
                原修复。随后 30% 过氧化氢孵育 15 min，BAS 液                    表达是否为胃癌患者预后的独立风险因素，用
                封闭 20 min，滴加 CLEC5A 抗体（1∶500），4 ℃孵育               Kaplan⁃Meier 法和 log⁃rank 检验绘制生存曲线并分
                过夜。取出组织芯片复温 30 min 后磷酸盐缓冲液                        析预后因素。以α=0.05 作为组间比较的检验水
               （phosphate buffered saline，PBS）漂洗 3 次，滴加二抗         准。计量资料用 Shapiro⁃Wilk 行正态性检验，符合
                增强，室温孵育30 min后，滴加二抗室温孵育30 min                     正态分布计量资料用均数±标准差（x ± s）描述，不符
                后，DAB显色，苏木精复染，封片。                                 合正态分布计量资料用中位数（四分位数）［M（P25，
                1.2.4  多重免疫荧光染色（multiplex immunohisto⁃            P75）］表示。计量资料组间比较，采用两独立样本 t
                chemistry，mIHC）分析                                 检验分析，不符合条件用Mann⁃Whitney U非参数秩
                    使用Opal 7⁃Colour试剂盒按照使用说明书进行                   和检验，P < 0.05为差异有统计学意义。
                染色。首先，将组织芯片置于 70 ℃烤片机中烤片
                                                                  2 结    果
                90 min，再 60 ℃烘片 60 min，二甲苯脱蜡，梯度酒精
                中水化。接着，切片用10%甲醛固定10 min，并使用                       2.1  CLEC5A在胃癌和良性胃黏膜组织中的表达差
                AR6 缓冲液（AR600；AKOYA 公司，美国）进行抗原                    异与胃癌患者临床特征的相关性
                修复，待切片冷却至室温后，使用封闭液封闭切片                                为评估胃癌中 CLEC5A mRNA 的表达，使用
                10 min，阻断非特异性结合。切片在室温下与一抗                         TCGA RNA 测序数据进行初步分析。结果显示，
                孵育1 h，或者在4 ℃下过夜孵育后，用TBST溶液洗                       CLEC5A mRNA 在胃癌组织中（375 例）表达量显著
                涤 3 次以去除未结合的抗体。随后，按照相同的程                          高于良性胃组织（32例）（图1A）；而Kaplan⁃Meier 生
                序重复抗原修复并进行下一标记的染色，以标记不                            存曲线分析结果显示，在高与低 CLEC5A 表达组之
                同的生物标志物。最后，滴加 DAPI 进行细胞核染                         间 OS 差异无统计学意义（HR=1.1，P=0.64，图 1B）。
                色以及封片，为后续分析提供核定位信息。使用                             CLEC5A 的 mRNA 表达可能与胃癌的发生相关，与
                Vectra 3.0自动定量病理成像系统扫描切片，对切片                      患者的生存预后没有直接的显著关系。
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