Page 46 - 南京医科大学自然版

第46卷第9期
·1316 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2026年9月

pathway，characterized by the marked upregulation of the Notch1 protein and its downstream target gene Hes1（P < 0.05）. Treatment
with DAPT not only effectively inhibited the hyperactivation of the Notch1 pathway in Pin1 knockout cells but also significantly
reduced their proliferation rate. Conclusion：Pin1 functions as a negative regulator in C17.2 NSCs，restricting excessive cellular
proliferation by inhibiting the Notch1 signaling pathway. These findings reveal a novel mechanism by which Pin1 maintains
proliferation homeostasis during the development of embryonic NSCs.
［Key words］ Pin1；Notch1；CRISPR/Cas9；neural stem cell；proliferation
［J Nanjing Med Univ，2026，46（09）：1315⁃1322，1330］

肽基脯氨酰顺反式异构酶永不分裂基因A相互 及增殖的影响；同时结合高通量RNA⁃Seq 转录组测

作用蛋白（peptidyl⁃prolyl cis⁃trans isomerase，never 序技术，解析 Pin1 敲除所引起的差异表达基因，揭
in mitosis A⁃interacting 1，Pin1）基因编码一种高度保 示 Pin1 在胚胎 NSC 中作为潜在增殖调控因子的分
守的特异性肽酰⁃脯氨酰顺反异构酶。它是目前已知 子机制，为神经系统相关疾病的机制探索提供新的
的唯一能够识别并结合磷酸化丝氨酸/苏氨酸⁃脯氨酸 理论依据。
（pSer/Thr⁃Pro）基序的蛋白，通过催化该位点肽键的
1 材料和方法
顺反异构化，诱导靶蛋白构象改变，进而调节其稳定
性、亚细胞定位及催化活性 ［1-2］ 。Pin1的底物谱极为 1.1 材料
广泛，涵盖 p53、β⁃淀粉样前体蛋白等多种蛋白 ［3-5］ 。 C17.2 NSC（IM⁃M072，厦门细胞资源平台逸漠
既往研究表明，Pin1通常作为细胞增殖的“正向调节 生物）；DMEM 培养基（Gibco 公司，美国）；青链霉素
因子”，在多种肿瘤细胞中高表达并驱动细胞周期的 （penicillin ⁃ streptomycin，PS）、多聚甲醛（paraform ⁃
进程 ［6-9］ 。然而，Pin1 的功能具有高度的细胞类型依 aldehyde，PFA）、二甲基亚砜（dimethyl sulphoxide，
赖性，其在神经系统发育特别是神经干细胞（neural DMSO）（Sigma 公 司 ，美 国）；0.25% Trypsin ⁃ 0.02%
stem cell，NSC）的增殖与分化中的具体调控机制仍有 EDTA（Gibco 公司，美国）；PX330（Addgene 公司，美
待深入阐明 ［10-12］ 。 国）；DH5α感受态、质粒中提试剂盒（北京天根生
NSC的自我更新与分化是神经系统发育及损伤 化科技公司）；DNA Marker DL2000、pMD18⁃T 载体
修复的基础 ［13-14］ ，NSC 移植在神经退行性疾病及其 （TaKaRa 公司，日本）；胶回收试剂盒（Qiagen 公司，
他脑损伤的治疗中备受关注 ［15-17］ ，其临床价值日益 德国）；BbsⅠ限制性内切酶（New England Biolabs 公
凸显。C17.2神经前体细胞系（常称为C17.2神经干 司，美国）；PEI40000 液体 DNA 转染试剂（上海拓然
细胞系）来源于新生小鼠小脑组织，通过逆转录病 生物科技有限公司）；G418（遗传霉素）（Thermo
毒介导 v⁃myc 癌基因永生化处理后，不仅保留了多 Fisher Scientific 公 司 ，美 国）；RNApure FAST Tis⁃
向分化潜能与干细胞核心特性，还具备稳定的自我 sue&Cell Kit 试剂盒、HiFiScript All⁃in⁃one RT Master
更新能力，是解析神经发育早期分子机制的经典体 Mix for qPCR 试剂盒、MixTaq 酶（泰州康为世纪公
外模型 ［18］ 。已有研究指出，Pin1在成体神经发生及 司）；Mouse anti⁃Nestin（BD Biosciences 公司，美国）；
神经退行性疾病（如阿尔茨海默病）中扮演重要角色， Rabbit anti ⁃ KI67、Goat anti ⁃ rabbit IgG Alexa Fluor
通常被认为有助于维持神经元的存活与功能 ［11，19］ 。 594、Goat anti⁃mouse IgG Alexa Fluor 488（Abcam 公
但是，在胚胎发育阶段的神经干细胞中，Pin1 是否 司，英国）；Rabbit anti⁃cleaved Notch1（NICD）（Cell
通过特定的信号通路（如Notch、Wnt等）精确调控细 Signalling Technology，美国）；Rabbit anti⁃Pin1（Pro⁃
胞的增殖速率，目前尚缺乏系统的实验证据。 teintech公司，美国）；Mouse anti⁃β⁃actin（武汉abclonal
鉴于此，本研究利用 CRISPR/Cas9 基因编辑技 公司）；DAPI（Te⁃dia公司，美国）。
术，构建了 Pin1 稳定敲除的 C17.2 NSC 模型。相比 1.2 方法
传统的 RNA 干扰技术，CRISPR/Cas9 系统能够实现 1.2.1 C17.2 NSC复苏
基因的完全敲除，从而彻底消除Pin1蛋白的背景表 将含有细胞悬液的冻存管在 37 ℃水浴中迅速
达干扰 ［20-21］ 。本研究旨在通过构建 Pin1 敲除 NSC， 摇晃解冻，加完全培养基混合均匀。1 000 r/min 离
明确 Pin1 缺失对 C17.2 细胞干性维持（Nestin 表达） 心 3 min，弃去上清液，加完全培养基后轻柔吹匀。