Page 48 - 南京医科大学自然版

第46卷第9期
·1318 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2026年9月

表1 PCR引物序列
Table 1 Sequence of PCR primers
Primers Forward（5′→3′） Reverse（5′→3′）
Alcam TCCTGCCGTCTGCTCTTCT TTCTGAGGTACGTCAAGTCGG
Ramp1 GAGACTATTGGGAAGACGCTATG CTCCTCCAGACCACCAGTG
Rictor GCTAGGTGCATTGACATACAACA AGTGCTAGTTCACAGATAATGGC
Hes1 TCAACACGACACCGGATAAAC GCCGCGAGCTATCTTTCTTCA
Notch3 TGGCGACCTCACTTACGACT CACTGGCAGTTATAGGTGTTGAC
Actb GGCTGTATTCCCCTCCATCG CCAGTTGGTAACAATGCCATGT

行多重检验校正，以校正后P值或FDR<0.05作为显 共转染 C17.2 NSC。经 G418 筛选 10~15 d 后，获得
著富集的判定标准。 20个抗性的单细胞克隆。选取其中6个生长状态良
好的单细胞克隆进行PCR及测序鉴定。结果显示，
2 结 果
其中3个细胞克隆在Pin1靶点发生了双等位基因突
2.1 构建靶向小鼠 Pin1 基因的 CRISPR/Cas9 打靶 变（表 2），提示为 Pin1 纯合敲除的细胞克隆。选取
载体 其中的8#单细胞克隆用于后续功能验证，其基因型

利 用 CHOPCHOP 在 线 工 具（https：//chopchop. 鉴定结果如图 2A 所示。免疫荧光染色（图 2B）及
cbu.uib.no/），针对小鼠 Pin1 外显子 2 设计特异性的 Western blot（图 2C）结果均显示，野生型（wild type，
sgRNA，将合成的sgRNA寡核苷酸链退火后，克隆至 WT）NSC 中 Pin1 蛋白正常表达，而 8#细胞克隆中

经 Bbs Ⅰ 酶 切 线 性 化 的 pX330 质 粒（addgene # Pin1 蛋白表达完全缺失，证实 CRISPR/Cas9 基因编
42230）。Sanger 测序结果证实，靶向 Pin1 的 CRIS⁃ 辑技术成功实现了 Pin1 基因的敲除。为评估 Pin1
PR/Cas9打靶载体构建成功（图1A、B）。 基因敲除是否影响 NSC 的干性，检测了NSC标志物
2.2 Pin1基因敲除的神经干细胞克隆的筛选与鉴定 Nestin的表达。免疫荧光结果显示，Pin1基因敲除后
将 Pin1 打靶载体和带有新霉素抗性基因质粒 的 NSC 仍维持高水平的 Nestin 表达（图 2D），表明

A AGCCAGTGGGAGCGGCCCAG B sgRNA
AAGGACGAAA c a c c g a g c c a g t g g g a g c g g c c c a gGTTTTAGAG
sgRNA AAGGACGAAACACCGAGCCAGTGGGAGCGGCCCAGGTTTTAGAG
Pin1 Exon 1 Exon 2 Exon 3 Exon 4

260 250 240 230
A：sgRNA targeting site of Pin1. B：Sequencing chromatogram of the Pin1 gene targeting vector.
图1 构建靶向Pin1的CRISPR/Cas9表达载体
Figure 1 Construction of Pin1 gene⁃targeting vector via CRISPR/Cas9 system

-/-
表2 Pin1 单细胞克隆的基因型
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Table 2 Genotypes of Pin1 colonies
Colonies Pin1 Indel
Wild type ACGCCAGCCAGTGGGAGCGGCCCAGCGG WT
3# ACGCCAGCCAGTGGGAGCG---CAGCGG -3/+1 bp
ACGCCAGCCAGTGGGAGCGGCCCCAGCGG
8# ACGCCAGCCAGTGGGAGCG---CAGCGG -3/-1 bp
ACGCCAGCCAGTGGGAGCGGCC-AGCGG
21# ACGCCAGCCAGTGGGAGCGGCCCA-CGG -1/-3/+1 bp
ACGCCAGCCAGTGGGAGCG---CAGCGG
ACGCCAGCCAGTGGGAGCGGCCCCAGCGG