Page 47 - 南京医科大学自然版
P. 47
第46卷第9期 潘 婷，汪 静，孙晓琦，等. Pin1负向调控Notch1信号通路抑制神经干细胞增殖［J］.
2026年9月 南京医科大学学报（自然科学版），2026，46（9）：1315-1322，1330 ·1317 ·
然后将所有细胞悬液加入培养皿中，放入37 ℃、5% 1.2.6 Pin1敲除和野生型的C17.2 NSC免疫荧光染色
的CO2培养箱培养。定期检查细胞密度，C17.2 NSC 将待测C17.2 NSC进行细胞爬片，PBS清洗3遍，
细胞单层贴壁生长，在显微镜下观察到的形态呈现 然后用 4% PFA 固定 20 min，PBS 清洗 3 遍，加入
长梭形，扁平态。 Triton X⁃100通透20 min后，PBS清洗3遍，室温封闭
1.2.2 C17.2 NSC的传代与培养 1 h，加入一抗，4 ℃过夜，PBS 清洗3遍，加入荧光标
弃去培养皿上清，用磷酸缓冲盐溶液（phos⁃ 记二抗，室温避光孵育1 h，PBS清洗3遍，滴加DAPI
phate buffered saline，PBS）润洗细胞1~2次。然后加 抗淬灭剂，避光孵育 5 min，荧光显微镜拍照。一
消化液（0.25% Trypsin⁃0.02% EDTA）于培养皿中， 抗稀释比例：Pin1（1∶500）、Nestin（1∶300）、BrdU
使消化液浸润所有细胞，37 ℃培养箱中消化1~3 min， （1∶500）、Ki67（1∶1 000）。
然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变 1.2.7 Pin1敲除C17.2 NSC的转录组学分析
圆并脱落，迅速拿回操作台，加少量完全培养基终止 将Pin1敲除和野生型C17.2 NSC分别收集并委
消化。轻轻打匀后装入无菌离心管中，1 000 r/min离 托诺禾致源科技股份有限公司进行转录组测序，分
心 5 min，弃去上清液，加完全培养基后吹匀。将细 别设置 WT 组、Pin1 组，每组各 5 个样本。利用诺
-/-
胞悬液按 1∶3 或 1∶4 比例分到新的培养皿，置于培 禾致源网站对转录组结果进行分析，首先将得到的
养箱中培养。 基因 read count 利用 DESeq2 的方法标准化，按照
1.2.3 sgRNA的设计与CRISPR/Cas9载体构建 |log2 （fold change）|≥1.0，Padj≤0.05的标准筛选差异表
根 据 在 NCBI 中 已 查 找 到 的 小 鼠 Pin1 基 因 达基因（differentially expressed gene，DEG）。其次，
序列（Gene ID：23988），设计靶向 Pin1 第 2 个外 对差异基因以Padj<0.05作为显著性富集的阈值进行
显子的 sgRNA，合成 5′磷酸化修饰的寡核苷酸： 京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of
sgRNA⁃F：5′⁃CACCGAGCCAGTGGGAGCGGCCCAG⁃ Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析。提取注
3′，sgRNA⁃R：5′⁃AAACCTGGGCCGCTCCCACTGGC⁃ 释到KEGG数据库的基因集对其进行聚类分析。将
TC⁃3′（上海生工生物工程股份有限公司合成）。寡 获得的数据利用 hiplot 网站（https：//hiplot.com.cn/）对
核苷酸退火后克隆到BbsⅠ酶切的pX330质粒，转化 结果进行可视化呈现。
DH5α感受态细菌，涂布于溶菌肉汤（Luria⁃Bertani， 1.2.8 qRT⁃PCR检测基因mRNA水平
LB）固体培养基进行培养，37 ℃培养箱过夜。8~12 h后 收集野生型、Pin1 敲除以及敲除后用 DAPT 处
可挑取单克隆菌落，测序确定正确的重组子。 理后的 C17.2 神经干细胞沉淀到 EP 管中，用 PBS 清
1.2.4 细胞转染及单克隆细胞的筛选和鉴定 洗1遍；根据RNApure FAST Tissue&Cell Kit试剂盒，
转染前，在培养皿中铺板 C17.2 NSC，直至细胞 提取细胞的RNA（取少量RNA溶液进行核酸凝胶电
密度达60%~80%。根据拓然生物PEI40000说明书 泳，查看 RNA 质量情况）并测定浓度。将上述提取
配制DNA⁃PEI转染复合物，然后将DNA⁃PEI转染复 总 RNA 使用 HiFiScript All⁃in⁃one RT Master Mix for
合物逐滴均匀加入到细胞培养基中充分混匀，于培 qPCR 试剂盒逆转录为 cDNA；利用 NCBI 网站和
养箱中培养 18~72 h。然后用 0.25% Trypsin⁃0.02% PrimerBank网站设计靶向小鼠目的基因的qRT⁃PCR
EDTA消化重悬成细胞悬液，转移至10 cm皿中进行 引物，按实时荧光定量PCR说明书检测。引物序列
铺板培养。在细胞贴壁后用含有 1 mg/mL G418 的 见表1。
无血清培养基继续培养，10~15 d 后，可获得单细胞 1.3 统计学方法
克隆。提取细胞克隆的基因组进行 PCR 扩增和测 本研究采用 GraphPad Prism 9.5 软件进行统计
序鉴定。 分析。计量资料以均值±标准差（x ± s）表示，采用
1.2.5 Western blot验证敲除效果 Shapiro⁃Wilk 检验进行正态性检验。两组间比较采
收集待测细胞沉淀，经过 RIPA 裂解提取蛋 用双尾独立样本 t 检验；多组间比较采用单因素方
白，经过SDS⁃PAGE 电泳分离、转膜、封闭，4 ℃孵育 差分析（one⁃way ANOVA），两两比较采用 Tukey 事
一抗过夜，取出清洗3遍，室温孵育二抗（1∶8 000）， 后多重比较检验。P < 0.05 为差异有统计学意义。
再清洗 3 遍，最后加入 ECL 发光显色。一抗稀释比 对RNA⁃seq获得的差异表达基因进行KEGG通路富
例：Pin1（1∶1 000）；cleaved⁃Notch1（1∶1 000）；β⁃actin 集分析时，采用基于超几何分布的Fisher确切概率法
（1∶8 000）。 评估富集显著性，并采用Benjamini⁃Hochberg 方法进
