Page 30 - 南京医科大学自然科学版第1期

第41卷第1期
· 24 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2021年1月

过表达质粒和miR⁃449a模拟物组）用不含 EDTA 的 1.3 统计学方法
胰酶消化收集后，室温条件下，2 000 r/min 离心 5~ 采用 SPSS10.0 统计软件进行分析。数据以均
10 min，收集细胞。用预冷 1×PBS（4 ℃）重悬细胞 数±标准差（x ± s）表示，两组比较采用 t 检验，P＜
1 次，2 000 r/min 离心 5~10 min，洗涤细胞；加入 0.05为差异有统计学意义。
300 μL 的 1×Binding Buffer 悬浮细胞；加入 5 μL
2 结 果
Annexin V⁃FITC混匀后，避光，室温孵育 15 min；上机
前 5 min 再加入 5 μL PI 染色；上机前，补加 200 μL 2.1 miR⁃449a 过表达抑制 BE（2）⁃C 细胞增殖和克
1×Binding Buffer。流式细胞仪检测。 隆形成
1.2.7 免疫印迹实验 将miR⁃449a模拟物转染到BE（2）⁃C细胞中，转

总细胞蛋白通过标准流程提取和定量。BE（2）⁃C 染48 h后收取细胞qPCR检测miR⁃449a表达量。由
细胞加入添加了蛋白酶抑制剂和 PMSF 的 RIPA 试 图1A可见，转染miR⁃449a模拟物后，miR⁃449a表达
剂，置于冰上 30 min，13 000 g 4 ℃离心 15 min 后收 量显著升高，说明miR⁃449a模拟物达到了过表达miR
集上清。采用 BCA 试剂盒测定蛋白浓度。取等量 ⁃449a的目的。随后发现过表达miR⁃449a会显著抑
蛋白加入 SDS⁃PAGE 胶并将样品转移至 PVDF 膜 制BE（2）⁃C细胞增殖（图1B），降低细胞克隆形成能
上。将膜置于5%脱脂奶粉溶液于室温孵育2 h。随 力，对照组克隆数目为（684±25）个，而转染miR⁃449a
后4 ℃孵育一抗MDM4（1∶1 000）、MDM2（1∶1 000）、 模拟物组克隆数目为（114±23）个（图1C、D）。
p53（1∶1 000）、cleaved PARP（1∶2 000）、GAPDH（1∶ 2.2 MDM4是miR⁃449a的靶基因
1 000）过夜。 为了研究miR⁃449a的作用机制，运用在线数据

A 0.08 * B 0.8 对照组 C 对照组 miR⁃449a组 D （ 个 ） 800
miR⁃449a相对表达量 0.06 nm ） （ 450 D 0.6 * 克隆数目 600 0 *
miR⁃449a组

0.4
400
0.04
0.2
200
0.02
0.0
0.00
miR⁃449a组
对照组
0 h
24 h
72 h
48 h
miR⁃449a组
对照组
A：miR⁃449a模拟物转染BE（2）⁃C细胞后，qRT⁃PCR检测miR⁃449a表达量；B：miR⁃449a模拟物转染BE（2）⁃C细胞后，CCK⁃8检测细胞增殖
能力的变化；C、D：miR⁃449a模拟物转染BE（2）⁃C细胞后，检测细胞克隆形成能力的变化。与对照组比较，P < 0.001（n=3）。
*
图1 miR⁃449a过表达抑制BE（2）⁃C细胞增殖和克隆形成
Figure 1 miR⁃449a overexpression inhibits cell proliferation and colony formation in BE（2）⁃C cell line
库 miRDB 预测 miR⁃449a 的靶基因。结果发现在评 可以得出结论，MDM4是miR⁃449a的1个靶基因。
分为 100 的预测靶基因中，存在 1 个 p53 调节基因 2.3 干扰 MDM4 表达可以显著降低 BE（2）⁃C 细胞
MDM4。于是运用荧光素酶表达系统验证MDM4是 增殖和克隆形成能力
否为 miR⁃449a 的靶基因。如图 2A 和 2B 所示，将包 为了研究 miR⁃449a 的靶基因 MDM4 对于神经
含2个预测位点的MDM4野生型（MDM4⁃WT）3′UTR 母细胞瘤的作用，从而进一步阐明miR⁃449a的作用
区域克隆到荧光素酶报告质粒 pGL3 中，并同时构 机制，本研究合成 MDM4 的 siRNA 并将 siMDM4 和
建针对 2 个位点的突变型（MDM4⁃mut1、MDM4⁃ miR⁃449a模拟物分别或同时转染BE（2）⁃C细胞。
mut2、MDM4⁃mut1⁃2）质粒。荧光素酶结果显示，与 通过CCK⁃8法检测了细胞24、48及72 h的增殖
空载组相比，miR⁃449a 过表达显著降低转染了 情况。如图3A所示，siMDM4和miR⁃449a模拟物均
MDM4野生型和突变型质粒组的荧光素酶活性。另 可显著抑制BE（2）⁃C细胞增殖，并且siMDM4和miR⁃
外，与转染MDM4野生型质粒组相比，转染MDM4突 449a模拟物对于BE（2）⁃C细胞增殖抑制效果近似，
变质粒后荧光素酶活性显著升高（图 2C）。接下来 同时转染 miR⁃449a 和 siMDM4 没有表现出叠加效

将 miR⁃449a 的模拟物转染到细胞中，检测 MDM4 应。该结果进一步表明，miR⁃449a 通过调控 MDM4
mRNA 和蛋白水平的变化。结果显示，转染 miR⁃ 从而抑制BE（2）⁃C细胞增殖。
449a 后 MDM4 的表达水平均降低（图 2D、E）。因此 克隆形成试验结果显示，siMDM4 和 miR⁃449a