Page 31 - 南京医科大学自然科学版第1期

第41卷第1期 程 涛，张 生，姚 远，等. microRNA⁃449a通过调控MDM4抑制神经母细胞瘤生长［J］.
2021年1月 南京医科大学学报（自然科学版），2021，41（01）：022-028 · 25 ·

A
MDM4 3′UTR（site 1，pos 4 203~4 211） MDM4 3′UTR（site 2，pos 4 338~4 344）
5′ AGAUUUUUUUUACUCACUGCCA 3′ 5′ UGGUGUUUCUGGAGCACUGCCA 3′

3′ UGGUCGAUUGUUAUGUGACGGU 5′ 3′ UGGUCGAUUGUUAUGUGACGGU 5′
miR⁃449a miR⁃449a

B Site 1 Site 2
3′UTR 3 900 4 203 4 338 4 600
MDM4⁃WT CACUGCCA CACUGCCA
MDM4⁃mut1 GUGACGGC CACUGCCA
MDM4⁃mut2 CACUGCCA GCGACGAU
MDM4⁃mut1⁃2 GUGACGGC GCGACGAU
（ % ） 150 0.06 MDM4 55 kDa
C D 0.08 E 对照组 miR⁃449a组
荧光素酶活性/对照 100 0 空载 * #* #* #* MDM4相对表达量 0.04 对照组 miR⁃449a组 GAPDH 36 kDa
*
0.02
50
0.00
MDM4⁃mut2
MDM4⁃mut1⁃2
MDM4⁃mut1
MDM4⁃WT
A：预测得出的miR⁃449a与MDM4 3′UTR区域的2个结合位点；B：根据预测的结合位点构建的MDM4⁃WT和对应MDM4⁃mut荧光素酶质
粒；C：BE（2）⁃C细胞中分别转染空载、MDM4⁃WT、MDM4⁃mut1、MDM4⁃mut2和MDM4⁃mut1⁃2质粒，同时过表达miR⁃449a，检测各组荧光素酶活
*
#
*
性的变化；与空载比较，P < 0.001；与MDM4⁃WT比较，P < 0.001（n=3）；D：qRT⁃PCR检测MDM4 mRNA水平的变化；与对照组比较，P < 0.001
（n=3）；E：免疫印迹检测MDM4蛋白水平的变化。
图2 MDM4是miR⁃449a的靶基因
Figure 2 MDM4 is a target gene of miR⁃449a

模拟物均可显著抑制 BE（2）⁃C 细胞克隆形成，并且 物所引起的细胞凋亡和p53蛋白量的增加
siMDM4 和 miR⁃449a 模拟物抑制效果近似；同时转 为了进一步验证上述结论，单独或共同转染
染miR⁃449a和siMDM4组克隆形成能力与分别转染 miR⁃449a模拟物和MDM4过表达质粒后，观察细胞
siMDM4 或 miR⁃449a 模拟物没有显著差别（图 3B、 增殖能力的变化。结果显示，与对照组相比，单独
C）。上述结果表明，miR⁃449a通过调控MDM4从而 转染MDM4过表达质粒会增加细胞增殖能力，单独
抑制BE（2）⁃C细胞增殖和克隆形成。 转染miR⁃449a可以降低细胞增殖能力，但是同时转

2.4 过表达 MDM4 可以抵消由转染 miR⁃449a 模拟 染 miR⁃449a 和 MDM4 会对由转染 miR⁃449a 导致的

A 对照组 B 对照组 miR⁃449a组 C
siMDM4组 （ 个 ） 1 000
800
miR⁃449a组
1.0 600
miR⁃449a+siMDM4组 400
nm ） 0.8 * * * 克隆数目 200 * * *
0.6
（ 450 D 0.4 siMDM4组 siMDM4+miR⁃449a组 0 对照组 siMDM4组
siMDM4+miR⁃449a组
0.2
0.0 miR⁃449a组
0 h 24 h 48 h 72 h

A：siMDM4或/和miR⁃449a模拟物分别转染BE（2）⁃C细胞并通过CCK⁃8法检测了细胞不同时间点增殖情况；B：siMDM4或/和miR⁃449a模
拟物分别转染BE（2）⁃C细胞后，检测细胞克隆形成能力的变化；C：不同分组克隆数目的统计。对照组：BE（2）⁃C细胞；miR⁃449a组：转染miR⁃
*
449a 模拟物；siMDM4 组：转染 MDM4 干扰质粒；siMDM4+miR⁃449a 组：同时转染 miR⁃449a 模拟物和 MDM4 干扰质粒。与对照组比较，P <
0.001（n=3）。
图3 干扰MDM4表达抑制肿瘤细胞增殖和克隆形成
Figure 3 Silencing of MDM4 inhibits cell proliferation and colony formation in BE（2）⁃C cell line