Page 29 - 南京医科大学自然科学版第1期
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第41卷第1期          程   涛，张 生，姚 远，等. microRNA⁃449a通过调控MDM4抑制神经母细胞瘤生长［J］.
                  2021年1月                     南京医科大学学报（自然科学版），2021，41（01）：022-028                       · 23  ·


                            ［4］
                造成不良预后 。因此，对神经母细胞瘤病理发生和                           更换1次。所有实验都采用对数生长期细胞进行。
                分子机制的进一步研究可以帮助我们发现新的治疗                            1.2.2 实时荧光定量PCR（qPCR）
                策略从而有效控制神经母细胞瘤。                                       用 TRIzol 试剂提取总 RNA 并使用广谱分析仪
                    microRNA（miRNA）是内源表达的小型非编码                    确定 RNA 质量，随后使用 cDNA 第一链合成试剂盒
                RNA，大量研究表明 miRNA 在肿瘤发生中发挥重                        将RNA逆转录为cDNA，采用SYBR Green PCR Mas⁃
                要作用   ［5-6］ 。miR⁃449a 在许多肿瘤中发挥肿瘤抑制                ter Mix 和应用生物系统 7500 实时 PCR 系统进行定
                因子的功能，包括视网膜母细胞瘤、肺癌、前列腺                            量聚合酶链反应，PCR 引物通过 Premier3.0 软件进
                癌等  ［7-9］ 。近期，有文献报道 miR⁃449a 可以通过诱                行设计并通过上海生工合成。引物序列为：MDM4，
                导细胞分化和细胞周期阻滞进而抑制神经母细胞                             上游 5′⁃AGGTCCAGCCTAGATGTTTC⁃3′，下游 5′⁃
                瘤 ［10］ 。但是 miR⁃449a 在神经母细胞瘤中是否存在                  AGGTCCAGCCTAGATGTTTC⁃3′；β⁃actin，上游 5′⁃
                其他作用机制仍不清楚。                                       CCTGGCACCCAGCACAAT ⁃ 3′ ，下 游 5′ ⁃ GGGCCG⁃
                    MDM2 和 MDM4 含有相似的蛋白结构，都包含                     GACTCGTCATAC⁃3′。反应条件为：95 ℃ 10 min；
                1 个锌指结构域、1个与p53 N 端相连的N端结构域                       95 ℃，15 s；60 ℃，45 s，40个循环；95 ℃，15 s；60 ℃，
                以及 C 端的 RING（really interesting new gene）结构       1 min；95 ℃，15 s；60 ℃，15 s。基因相对表达水平根
                域。MDM2 和 MDM4 均被报道对 p53 发挥抑制作                     据公式2    -ΔCT 进行计算。
                用。MDM2 的作用机制已被广泛研究，主要是通过                          1.2.3 CCK⁃8试验
                与p53直接结合抑制其转录因子活性及促进p53的                              于实验前日接种细胞 3 000 个/孔（对照组和转
                泛素化降解。 MDM4主要是通过调节p53的活性发                         染miR⁃449a模拟物组）于96孔培养板中。将培养板
                                                     ［11］
                挥作用，协同MDM2发挥其泛素蛋白酶活性 。文献                          放入培养箱培养过夜（37 ℃、5% CO2 ）。培养次日，
                报道MDM4在早期胚胎发育过程中可以负向调控由                           去除培养液并向培养板中加入100 μL CCK⁃8检测溶
                p53 诱导的细胞周期阻滞和神经细胞凋亡                  ［12］ ，然而    液（包含90 μL培养基和10 μL CCK⁃8），培养1 h。随
                MDM4在神经母细胞瘤的作用机制仍有待探索。本                           后测定450 nm处吸光度值。
                研究分析了 miR⁃449a 对神经母细胞瘤细胞凋亡的                       1.2.4 克隆形成试验
                影响，并评价了 miR⁃449a 对肿瘤细胞生长、细胞凋                          接种 3 000 个处理后的细胞（对照组和转染
                亡和相关基因表达的调控。                                      miR⁃449a 模拟物组）于 6 孔培养板中。将培养板放
                                                                  入37 ℃，5% CO2的培养箱中继续培养3周，每3 d更
                1  材料和方法
                                                                  换1次培养液。3周后将培养液吸出加入4%多聚甲
                1.1  材料                                           醛固定 15 min。然后去除固定液，加适量考马斯亮
                    人神经母细胞瘤细胞株BE（2）⁃C购于中国科学                       蓝染液染色20 min，然后用流水缓慢洗去染色液，空
                院上海生命科学研究所。DMEM 培养基、胎牛血清                          气干燥后拍照、计数。
                                                       TM
               （Gibco 公司，美国）；青霉素和胰酶、BeyoRT 2 cD⁃                  1.2.5 荧光素酶活性分析
                NA 第一链合成试剂盒、PMSF、BCA 蛋白定量试剂                           根据预测结果，分别将野生型和突变型 MDM4
                盒、CCK⁃8 试剂盒、Annexin V⁃FITC 细胞凋亡试剂                 基因的3′UTR区域克隆到pGL3载体中，并将载体和
                盒、考马斯亮蓝染色液（上海碧云天公司）；miR⁃449a                      miR449a的模拟物一同转染至BE（2）⁃C细胞中。荧
                模拟物、抑制物和p53干扰质粒（上海吉玛生物有限                          光素酶活性检测利用荧光素酶活性检测试剂盒来

                公司）。TRIzol 试剂（Invitrogen 公司，美国）；SYBR              完成。转染 48 h 后，吸取培养液，用磷酸盐缓冲液
                Green PCR Master Mix（TaKaRa 公司，日本）；荧光素           （PBS）洗 2 次。6 孔板每孔加入 260 μL 裂解液并用
                酶活性检测试剂盒（Promega 公司，美国）；所有抗体                      刮子将细胞收集到 1.5 mL 离心管中，12 000 r/min，
                均购自美国Abcam公司。                                     4 ℃离心15 min后收集上清。将100 μL细胞裂解液

                1.2  方法                                           加到96孔板中，然后每孔加入100 μL底物，迅速混
                1.2.1 细胞培养                                        匀后在发光仪上读取数值。
                    人神经母细胞瘤细胞株 BE（2）⁃C 培养基为                       1.2.6 流式细胞术检测细胞凋亡
                DMEM加10%胎牛血清，1%青霉素和胰酶。细胞置                             将处理后的细胞（对照组、转染 MDM4 过表达
                于含 5% CO2培养箱，37 ℃培养。细胞培养液每 2 d                    质粒组、转染 miR⁃449a 模拟物组、同时转染 MDM4
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