Page 14 - 南京医科大学学报自然科学版

第41卷第11期
·1576 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2021年11月

5′⁃TTTGGAACTGGCTTTCCATC⁃3′，下游：5′⁃AA⁃ 含量。
GATCTGCAGCTTTTCCACA⁃3′，扩增产物为123 bp； 1.3 统计学方法
Foxp3 上游：5′⁃CCCAGGAAAGACAGCAACCTT⁃3′， 计量资料以均数±标准差（x ± s）表示，进行单因
下游：5′⁃TTCTCACAACCAGGCCACTTG⁃3′，扩增产 素方差分析（ANOVA），各组间的比较采用 LSD 法。
物为 89 bp；内参β⁃actin：上游 5′⁃TTCCTTCTTGGG⁃ 应用SPSS 19.0 软件进行统计。P＜0.05为差异有统
TATGGAAT ⁃ 3′ ，下 游 ：5′ ⁃ GAGCAATGATCTT⁃ 计学意义。
GATCTTC⁃3′，扩增产物为203 bp。
2 结 果
1.2.4 Western blot 检 测 NLRP3、Caspase ⁃ 1p20、
RORγt、Foxp3蛋白表达水平 2.1 脾脏Th17细胞和Treg细胞比例的变化
提取培养细胞的总蛋白，测定样品蛋白浓度。 流式细胞术结果显示，各组间 Th17 和 Treg

取各组不同组分蛋白样品 60 μg，经 10%SDS⁃PAGE 细胞比例差异有统计学意义（F=124.32、148.58，
电泳分离后电转移膜，加入稀释后的一抗37 ℃孵育 P 均<0.01）。与空白对照组比较，Ng 感染组脾脏
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1 h，洗膜后加入稀释的特异性二抗及SP⁃HRP 37 ℃ Th17 细胞和 CD4 CD25 Foxp3 Treg 细胞比例升高。
孵育2 h，洗膜后用0.05%DAB缓冲液避光显色。 加入孕酮预处理后，脾脏 Th17 细胞比例随着孕
+
+
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1.2.5 ELISA 法 检 测 细 胞 培 养 上 清 中 IL⁃1β 和 酮作用浓度的增高而降低，CD4 CD25 Foxp3 Treg 细
Th17/Treg相关细胞因子IL⁃17、TGF⁃β、IL⁃10的含量 胞比例随着孕酮作用浓度的增高而增高，加入
按照试剂盒说明书进行操作，实验完成后用酶 1×10 mol/L 或 1×10 mol/L 孕酮能明显下调脾脏
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标仪在 450 nm 处测定吸光度值，根据制作的标准 Th17 细胞比例，上调 CD4 CD25 Foxp3 Treg 细胞比例
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曲线计算出各组样品的 IL⁃1β、IL⁃17、TGF⁃β、IL⁃10 （图 1）。
空白对照组 Ng组 Ng+1×10 mol/L孕酮组 Ng+1×10 mol/L孕酮组 Ng+1×10 mol/L孕酮组
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10 4 10 4 10 4 10 4 10 4
0.8% 9.8% 9.1% 5.2% 2.5%
10 3 10 3 10 3 10 3 10 3
10 2 10 2 10 2 10 2 10 2
IL⁃17 10 1 10 1 10 1 10 1 10 1
99.2% 90.2% 90.9% 94.8% 97.5%
10 0 10 0 10 0 10 0 10 0
10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4
CD4
10 4 10 4 10 4 10 4 10 4
0.4% 4.1% 4.6% 9.9% 12.5%
10 3 10 3 10 3 10 3 10 3
Foxp3 10 2 1 10 2 1 10 2 1 10 2 1 10 2 1
10
10
10
10
10
99.6% 95.9% 95.4% 90.1% 87.5%
10 0 10 0 10 0 10 0 10 0
10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4
CD25
图1 脾细胞中Th17细胞和Treg细胞比例（n=5）
Figure 1 The proportions of Th17 cells and Treg cells in murine splenocytes（n=5）
2.2 细 胞 内 NLRP3、Th17/Treg 特 异 性 转 录 因 子 高而降低，Foxp3 mRNA 表达水平随着孕酮浓度的
RORγt、Foxp3 mRNA表达的变化 增高而增高。加入1×10 mol/L或1×10 mol/L孕酮
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RT ⁃ PCR 结 果 显 示 ，各 组 间 NLRP3、RORγt、 能 明 显 降 低 Ng 刺 激 引 起 的 脾 细 胞 内 NLRP3、
Forp3 mRNA比较、差异均有统计学意义（F=126.48、 RORγt mRNA 表达水平，上调 Foxp3 mRNA 表达水
253.18、119.82，P均<0.01）。Ng 刺激小鼠脾细胞后， 平，与Ng组比较，差异有统计学意义（t=12.61、9.78、
细胞内 NLRP3、RORγt、Foxp3 mRNA 表达较空白对 13.29，P均<0.01，图2）。

照组明显增加，分别为空白对照组的 5.48 倍（t= 2.3 细胞内NLRP3、Caspase⁃1p20、RORγt、Foxp3蛋
9.46，P＜0.01）、6.18 倍（t=11.82，P＜0.01）和 2.74 倍 白表达的变化
（t=7.47，P＜0.01）。加入孕酮预处理后，细胞内 Western blot 结果显示，NLRP3、Caspase⁃1p20、
NLRP3、RORγt mRNA 表达水平随着孕酮浓度的增 RORγt、Foxp3 蛋白各组间差异有统计学意义（F=