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第41卷第3期         刘   雪，马春梅，王冰微，等. 炎症小体AIM2在小鼠肥胖发生过程中的作用和机制研究［J］.
                  2021年3月                     南京医科大学学报（自然科学版），2021，41（03）：317-323                       ·319 ·


                37 ℃、5% CO2培养箱中培养 7 d，每 2 天更换 1 次新                5′⁃GTCCCAGCGTCGTGATTAGC⁃3′，下游引物 5′⁃
                鲜的培养基。                                            TGGCCTCCCATCTCCTTCA⁃ 3′；IL⁃6 上游引物 5′⁃
                1.2.4 巨噬细胞的刺激和极化                                  CTTGGGACTGATGCTGGTGAC⁃3′，下游引物 5′⁃GC⁃
                    取出小鼠骨髓，将分化成熟的巨噬细胞按                            CATTGCACAACTCTTTTCTC⁃3′；TNF⁃α上游引物5′⁃
                3×10 个/孔接种到 12 孔板，用含有 10% L929 培养                 TTCCCAAATGGCCTCCCT⁃3′，下游引物5′⁃ TGGGC⁃
                    5
                基的 DMEM 培养基培养，12 h 后，将培养基换为正                      TACAGGCTTGTCACTC ⁃ 3′ ；iNOS 上 游 引 物 5′ ⁃
                常 DMEM 培养基，分别用 LPS（诱导巨噬细胞向 M1                     AGGGAATCTTGGAGCGAGTTG ⁃ 3′ ，下 游 引 物 5′ ⁃
                样巨噬细胞极化，浓度为200 ng/mL）和IL⁃4（诱导巨                    TGAGGGCTTGGCTGAGTGAG⁃3′；Arg1 上游引物5′⁃
                噬细胞向 M2 样巨噬细胞极化，浓度为 20 ng/mL）刺                    CACAGTCTGGCAGTTGGAAGC⁃3′，下游引物5′⁃TG⁃
                激细胞，24 h后收集细胞，分别用流式抗体F4/80和                       GTTGTCAGGGGAGTGTTG ⁃ 3′ ，Ym1 上 游 引 物 5′ ⁃
                CD86 标记 M1 型巨噬细胞，用流式抗体 F4/80 和                    CATTGGAGGATGGAAGTTTGG⁃3′，下游引物5'⁃GG⁃
                CD206 标记 M2 型巨噬细胞，进行流式检测。并对                       TACTGCCAGTCCAGGTTGA⁃3′，Mrc1 上游引物 5′⁃

                M1 型巨噬细胞分泌的促炎细胞因子 IL⁃6、TNF⁃α                      CTCAACCCAAGGGCTCTTCTAA⁃ 3′，下游引物 5′⁃
                和 iNOS，对 M2 型巨噬细胞分泌的促炎细胞因子                        AAGGTGGCCTCTTGAGGTATGT⁃3′。
                Arg1、Ym1、Mrc1进行基因表达分析。                            1.3  统计学方法
                1.2.5 流式细胞分析                                          数据采用 GraphPad Prism 7.0 软件进行统计学

                    将极化的巨噬细胞用消化酶 37 ℃ 消化 10 min                   分析，并以均值±标准差（x ± s）表示。组间比较采用
                后，加入培养基终止消化，收集细胞后，1 500 r/min离                    t检验，P < 0.05为差异有统计学意义。
                心5 min，去上清。加入PBS，5 000 r/min离心5 min，
                                                                  2  结 果
                然后每个样品加入100 μL含有流式抗体的染色液重
                悬，常温避光染色30 min。5 000 r/min离心3 min，弃               2.1  AIM2在高脂诱导的小鼠肥胖模型中的表达
                上清，加上染色液重悬，上机检测。                                      为了探究AIM2在肥胖发生中的作用，分别给予
                1.2.6 HE染色                                        野生型（WT）小鼠正常饮食和60%高脂饮食15周后，
                    组织甲醛固定 48 h，石蜡包埋，切片，二甲苯脱                      取小鼠性腺周围脂肪组织，基因水平分析 AIM2 的
                蜡，再使用逐级降浓度酒精水化，无水酒精1~2 min，                       表达情况，结果显示，在高脂诱导的肥胖小鼠中，
                95%酒精 1~2 min，80%酒精 1~2 min，自来水洗。苏                AIM2表达显著下调（图1）。该结果提示AIM2对肥
                木素液染 5~10 min，自来水洗，1%盐酸酒精分化                       胖发生有重要的调节作用。
                0.5~1.0 min，流水冲洗 15 min，酒精脱水，95%酒精
                                                                           0.6
                1~2 min，无水酒精 1~2 min，二甲苯透明，盖玻片封                                            *
                片，等树胶干燥后，显微镜下采集图像，Image J 软件
                计算细胞面积。                                                    0.4
                1.2.7 RNA提取与定量PCR分析                                        AIM2 mRNA相对表达量
                    小鼠处死，收集小鼠附睾周围脂肪组织并匀                                    0.2
                浆，经过离心后，总 RNA 由 TRIzol 试剂盒提取后反

                转录合成 cDNA。使用 SYBR Green Supermix（Va⁃
                                                                             0
                zyme 公司，美国）进行 qRT⁃PCR。通过标准曲线方                                    正常饮食组        高脂饮食组
                                                                                       *
                法计算基因的表达，并以Hprt为内参基因将其标准                                        两组比较，P < 0.01（n=4）。
                                                                    图1 AIM2在高脂诱导的小鼠肥胖模型中的表达分析
                化。具体引物基因序列如下：AIM2上游引物5′⁃ CT⁃
                                                                  Figure 1  AIM2 expression level analysis in obesity mouse
                GAAAACTGCTCTGCTGCCT⁃3′，下游引物 5′⁃TGC⁃
                                                                          induced by high⁃fat food
                CACCATCTGTTTCTTCTGA⁃3′；FABP4 上游引物 5′⁃
                GGGGCCAGGCTTCTATTCC ⁃ 3′ ，下 游 引 物 5′ ⁃            2.2  AIM2在小鼠肥胖发生过程中发挥保护作用
                GGAGCTGGGTTAGGTATGGG⁃3′；PPARγ上游引物                     为了明确 AIM2 在肥胖发生中的具体功能，对

                5′⁃TCGCTGATGCACTGCCTATG⁃ 3′，下游引物 5′⁃              AIM2 敲除小鼠进行高脂饮食造模，对其体重、脂肪
                GAGAGGTCCACAGAG⁃CTGATT⁃3′；Hprt 上游引物               结构、葡萄糖耐受及胰岛素耐受情况进行分析。造
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