Page 28 - 南京医科大学学报自然科学版
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第40卷第6期41卷第3期
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                                                                                                   2021
               ·334 ·                            南 京    医 科 大 学 学         报                        2020年6月年3月

              带与相应的二抗在室温下孵育2 h，TBST缓冲液充分                        反应。反应条件：94 ℃变性 3 min；94 ℃ 30 s，58 ℃
              洗涤条带3次后用电化学发光检测系统观察条带。                            30 s，72 ℃ 30 s，热循环 35 次；最后 72 ℃延伸 5 min。
              1.2.8 实时定量聚合酶链反应（qRT⁃PCR）                         取 PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。
                  用 TRIzol 法 提 取 总 RNA，用 Prime Script RT        1.3  统计学方法
              Master Mix Perfect Real Time Kit 系列逆转录试剂将              对实验数据应用 Graphpad Prism7.0 和 SPSS 软
              RNA 逆转录为 cDNA，以该 cDNA 为扩增模板，用实                    件进行统计学分析，实验结果以均数±标准差（x ± s）
              时定量PCR试剂盒进行qRT⁃PCR扩增。引物序列：                        表示，多组比较采用单因素方差分析，组间两两比
              GAPDH 5′⁃GATCATCAGCAATGCCTCCT⁃ 3′（正义              较采用SNK法。P < 0.05为差异有统计学意义。
              链），5′⁃TGAGTCCTTCCACGATACCA⁃3′（反义链）；
                                                                2  结 果
              CHD4 5′⁃CAAAATGGCGGGAGTTCAGTA⁃3′（正义
              链），5′⁃CTCTCCACCACAGCTACCG⁃3′（反义链）；NF              2.1  CHD4基因促进Jurkat细胞增殖、抑制其凋亡
              ⁃ κB 5′ ⁃ AACAGAGAGGATTTCGTTTCCG ⁃ 3′（正 义              通 过 qRT ⁃ PCR 和 Western blot 检 测 siRNA ⁃
              链），5′⁃TTTGACCTGAGGGTAAGACTTCT⁃3′（反义               CHD4的敲低效率。CCK⁃8实验发现CHD4对Jurkat
              链）。qRT⁃PCR扩增条件：94 ℃ 预变性 5 min；90 ℃ 变              细胞的增殖有促进作用。流式细胞术检测，与对照
              性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃ 延伸 1 min，循环 40 次；           组相比，转染 siRNA⁃CHD4 的 Jurkat 细胞凋亡率

              72 ℃ 延伸5 min。反应仪器为 Step One Plus Quanti⁃          （55%~60%）明显上升。说明CHD4对Jurkat细胞的
                                                                凋亡具有抑制作用。与对照组比较，转染 siRNA⁃
              tative Realtime PCR System。记录各反应孔对应 Ct
              值以计算mRNA 相对表达量。内参基因为 GAPDH，                       CHD4 的 Jurkat 细胞 G0/G1 期比例显著升高，而 S 期
              目的基因为人 CHD4，CHD4 mRNA 的相对表达量                      比例下降7%~10%（图1）。
             （2 - ΔΔCt ）=CHD4 mRNA 拷贝数/GAPDH mRNA 拷贝            2.2  生物信息学分析人CHD4基因候选启动子区域

              数；ΔΔCt =（Ct 刺激组 CHD4-Ct 刺激组 GAPDH ）-（Ct 对照组 CHD4-Ct 对照  首先在 NCBI 网站及 UCSC 网站比对确认 CHD
              组GAPDH ）。 设对照组 mRNA 相对表达量为 1。                     基因的启动子区域。运用 Promoter 2.0 Prediction
              1.2.9 双荧光素酶活性测定                                   Serve（http：//www.cbs.dtu.dk/services/Promoter/）预测
                  收集 96 孔培养板中的细胞，弃去原培养基，用                       转录起始位点上游约2 000 bp、下游100 bp区域，结
              1×PBS洗涤3次，弃去PBS加入1×裂解缓冲液，室温                       果表明该区域具有启动子活性，再通过 Neural Net⁃
              振荡 30 min 充分裂解细胞。按照双荧光素酶活性                        work Promoter Prediction （http：//fruitfly.org/cgibin/
              检测试剂盒说明书，每孔取20 μL裂解液，分别加入                         seq_tools/promoter. pl）对该区域进行预测（图2）。
              20 μL底物缓冲液和20 μL终止缓冲液，混合后分别                       2.3  人CHD4基因候选启动子区扩增
              测定萤火虫荧光值和海肾荧光值。                                        CHD4基因预测启动子经PCR扩增，产物经1%
              1.2.10 CHIP实验检测                                   琼脂糖凝胶电泳显示有特异性条带出现，长度为
                  使用 EZ⁃Magna CHIP tm A 试剂盒，根据其说明               2 091 bp，与预测片段大小相符（图3）。
              书进行分析。将1×10 个Jurkat细胞在1%甲醛中室                      2.4  人 CHD4 基因候选启动子区 5′侧翼区截短序
                                  7
              温固定 10 min，超声检测细胞裂解产物，产生 200~                     列质粒构建
              1 000 bp 的 DNA 片段。然后用 anti⁃IgG 抗体、anti⁃                各截短序列质粒经 KpnⅠ、BglⅡ酶切，可见
              NF⁃κB 抗体（Abcam ab194729）和 anti⁃acetyl 组蛋白         pGL3⁃Basic载体片段（4 818 bp）和长度分别为 2 091、
              H3抗体进行免疫沉淀反应。经反向交联和DNA纯                           1 035、546、350、130 bp的序列片段（图4）。
              化后，使用 SYBR Green 进行 qRT⁃PCR 分析。引物                 2.5  人CHD4基因候选启动子区活性检测

              如下：上游引物 5′⁃GGGTTGGAGTTGGTTGAGGT⁃                       在 HEK293T 细胞和 Jurkat 细胞中进行荧光素
              3′，下游引物 5′⁃GGGTTGGAGTTGGTTGAGGT⁃3′。               酶检测,发现与阴性对照质粒pGL⁃3Basic相比，重组
              qRT⁃PCR扩增条件：94 ℃预变性5 min；90℃变性15 s，               质粒P1（pGL⁃1947/+117）的荧光素酶相对活性明显
              60 ℃退火15 s，72 ℃延伸1 min，循环40次；72 ℃延伸               增高，P1~P4的活性无明显差异（P＞0.05），P5（pGL⁃

              5 min。反应仪器为 Step One Plus Quantitative Real⁃      13/+117）与其他截短节段质粒相比，启动子活性明
              time PCR System。记录各反应孔对应 Ct 值以计算                  显降低（P＜0.05），与阴性对照pGL⁃3Basic相近。因
              mRNA 相对表达量。用 rTaq DNA 聚合酶进行 PCR                   此认为,CHD4基因启动子最小活性区域位于其5′侧
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