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第41卷第3期 杨彩霞，陆 超. CHD4基因表达对急性T淋巴细胞白血病细胞增殖和凋亡的影响及其启动子鉴定［J］.
2021年3月 南京医科大学学报（自然科学版），2021，41（03）：331-338 ·333 ·
后收集，95％乙醇4 ℃固定过夜，PBS洗涤3次，PI染 下进行双酶切1 h，酶切产物用切胶回收纯化试剂盒
色，37 ℃水浴30 min，流式细胞仪检测。 纯化，纯化产物用T4 DNA连接酶在37 ℃水浴中连接
1.2.3 CCK⁃8增殖分析 30 min。将连接产物转化至大肠杆菌DH5α中，转化
将 Jurkat 细胞以 4×10 个/孔铺于 96 孔板，每组 条件为4 ℃ 3 min，42 ℃水浴1 min 20 s，4 ℃ 30 min。
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5 个复孔，加 10 μL CCK⁃8 试剂，在 5％CO2、37 ℃条 取转化好的菌液加入1 mL不含氨苄青霉素的LB培
件下孵育2 h后用酶标仪测量每个孔在450 nm波长 养液，置于37 ℃摇床倒置扩增1 h，将扩增好的菌液
下的吸光度值，相同条件下连续测量4 d。 涂于含有氨苄青霉素的固体 LB 培养板，于 37 ℃、
1.2.4 CHD4基因候选启动子区生物信息学分析及 5%CO2培养箱中倒置培养过夜。在长出菌落的 LB
克隆 板上挑取单克隆菌落，加入含有氨苄青霉素的LB培
CHD4 基因候选启动子区生物信息学分析：从 养液中，37 ℃摇床倒置扩增3 h，以扩增后的菌液为
NCBI 数 据 库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/） 模板进行 PCR 扩增，PCR 反应条件同前。用 1%琼
GenBank 中获取人 CHD4 基 因 序 列（编 号：NC_ 脂糖凝胶对 PCR 产物电泳 30 min，选取阳性菌液进
000012.12）。 利 用 UCSC 网 站（http：//genome.ucsc. 行测序，将经测序鉴定正确的菌液加入含氨苄青霉
edu/）进行对比，取转录起始位点上游2 000 bp，下游 素的 LB 培养液中于 37 ℃摇床扩增过夜，扩增后的
100 bp 通 过 Neural Network Promoter Prediction 菌液用质粒提取试剂盒提取含有目的片段的质粒
（http：//fruitfly.org/cgi bin/seq_tools/promoter.pl）进 行 标记为P1（pGL⁃1974/+117）。以构建成功的质粒序
预测；再使用JASPAR（jaspar.genereg.net/）数据库5.0 列为模板，共用同一下游引物，上游引物分别为
版对CHD4基因核心启动子的转录因子结合位点进 P2~P5 进行 PCR，构建 CHD4 基因候选启动子区 5′
行预测。 侧翼区截短序列质粒，方法同上。
引物设计：以预测的 CHD4 基因候选启动子序 1.2.5 基因敲低分析
列为模板，用Prime5.0设计引物，再对该区域5′侧翼 双链siRNA的设计与合成由广州锐博生物科技
区截短序列设计引物。上下游引物 5′端分别加入 有限公司完成，siRNA 序列和阴性对照序列如下：
限制性内切酶 KpnⅠ和 BglⅡ的酶切位点及保护碱 siRNA⁃CHD4：5′⁃GCATGTCCTTACTAGAATT⁃3′（正
基。共用下游引物：5′⁃GGAAGATCTGAGGGGC⁃ 义链），5′⁃TAATTCTAGTAAGGACATGC⁃ 3′（反义
GTCTCTTTG⁃3′。上游引物分别是 P1（pGL⁃1974/ 链）；siRNA⁃NF⁃κB：5′⁃GCACCTAGCTGCCAAAGAA⁃
+117）：5′⁃CGGGGTACCAGTATCATCTTCCAGCCTC⁃ 3′（正义链），5′⁃TTCTTTGGCAGCTAGGTGC⁃3′（反义
TAGA⁃3′；P2（pGL⁃918/+117）：5′⁃CGGGGTACCTGT⁃ 链）；阴性对照：5′⁃UUCUCCGAACGUGUCACGUTT⁃
GGGGCGACAGTAGGG⁃3′；P3（pGL⁃428/+117）：5′⁃ 3′（正义链），5′⁃ACGUGACACGUUCGGAGAATT⁃3′
CGGGGTACCAGGGTTAGTTGCAAAAGGTCTG ⁃ 3′ ； （反义链）。
P4（pGL⁃233/+117）：5′⁃CGGGGTACCTGCCCAGGT⁃ 1.2.6 瞬时转染
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GACGCGCGCGC⁃3′；P5（pGL⁃13/+117）：5′⁃CGGGG⁃ Jurkat 细胞以 2×10 个/孔铺 12 孔板，12 h 后以
TACCGCCGGAGCCATTTTCCCC⁃3′（下划线部分为 500 ng/mL siRNA或表达质粒转染细胞，转染24 h后
限制性酶切位点，斜体部分为保护碱基）。引物合 收取RNA，48 h后收取蛋白质。启动子双荧光素酶
成由上海英骏公司完成。 检测，转染前18 h将生长状态良好的细胞置于96孔
Jurkat细胞全基因组DNA提取：Jurkat细胞全基 板（1×10 个/孔），使用Lipofectamine 3000将100 ng
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TM
因组DNA 提取按照基因组DNA 提取试剂盒的说明 CHD4 启动子荧光素酶报告质粒和 4 ng pRL⁃TK 质
书操作。 粒共同转染细胞。18 h后采用双荧光素酶报告基因
质粒构建：以Jurkat细胞全基因组DNA为模板， 检测系统检测启动子活性。
根据 TaKaRa LA TaqandGC buffer 催化酶说明书条 1.2.7 免疫印迹法（Western blot）
件进行催化扩增，条件如下：94 ℃ 1 min；94 ℃ 30 s， 用 8%~12%的 SDS⁃PAGE 电泳分离总蛋白，在
60 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30个循环。用1%的琼脂糖 转移缓冲液中将样品电转移到PVDF（聚偏氟乙烯）
凝胶对扩增产物进行电泳检测。切胶回收试剂盒 膜上。用 5%脱脂牛奶在室温下封闭 PVDF 膜 2 h，
回收琼脂糖电泳产物。回收产物与 pGL3⁃Basic 载 CHD4、GAPDH、NF⁃κB 抗体在摇床上孵育目的条带
体均用限制性内切酶KpnⅠ、BglⅡ在37 ℃水浴条件 4 ℃过夜。TBST缓冲液充分洗涤条带3次，将这些条
